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公布若干有关电磁场对神经细胞影响的研究进展（之一）：脉冲磁场对皮层神经元瞬时外向钾电流
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脉冲磁场对皮层神经元瞬时外向钾电流
影响的初步实验研究
1. 引言
现代科学的发展已经表明，任何空间都存在着或低或高的磁场，这些生物磁场及其变化与生物的生命活动、生理状态密切相关。随着生物磁技术的发展，有关磁场作用与生物学效应的研究，取得了积极的成果，不仅丰富了磁场疗法的基础理论，而且推动了磁场疗法的发展与深入，各类磁疗在医学中的基础和临床应用研究越来越广泛。现代科技的发展使人们越来越多的暴露在各种各样的磁场中，磁场对人体正常的机理有着何种影响，及其影响机理如何至今未明[1]。
低频脉冲磁场在促进骨折愈合[2]、改善血流变[3]、预防静脉血栓、脊髓损伤及脑创伤[4-6]等方面不断有研究报道；同时射频电磁场可对人体造成多种伤害也多见报道。在神经系统主要表现为神经衰弱，同时伴有植物神经功能失调的征候[7]。也可影响内分泌功能。微波可使精子数量减少，活动能力降低，甚至可发生暂时性不育。妇女在妊娠早期受微波照射可引起流产，分娩后可引起乳汁分泌量减少。人们又可以利用电磁场的生物学效应来治疗某些疾病，如促进骨折愈合用做肿瘤的辅助治疗等脉冲电磁场刺激对周围神经的再生有一定促进作用[8, 9]。
经过多年的研究磁场对于细胞膜有着特殊的影响[10]，特别是磁场的脉冲作用[11]，能够改变细胞膜两侧的离子分布，从而在某些创伤或是变性的组织产生的炎症反映中表现出治疗效应。磁场对生物膜效应有以下几个方面：磁场对于许多细胞内的酶系统有影响、它们影响了抗原和抗体的关系、它们使得细胞膜通透性发生了改变，从而改变了膜两侧离子平衡；实际上，在许多病理状态下，都有细胞膜势能的改变，膜的结构组织上出现的变化导致了细胞膜极性的翻转等。现阶段磁场生物效应没有明确的理论基础，很多对于此方面的原因的研究都处于假设阶段，因此对于电磁作用生物组织治疗机理的研究还在逐步进行中[12-15]。
2.材料与方法
2.1. 材料
动物：昆明小鼠，鼠龄10～14天，雌雄不限，天津医科大学动物实验中心提供。
试剂：链霉蛋白酶（Pronase），Merck公司产品。河豚毒素（TTX）、氯化镉（CdCl2）、氯化四乙胺（TEA-Cl）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、已二醇－双（2－氨基乙基）四乙酸（EGTA）、Na2ATP均为Sigma公司产品。其余为国产分析纯。
（1）人工脑脊液(ACSF, mmol/L)：NaCl 134，KCl 5，NaH2PO4 1.5，MgSO4 2，CaCl22， NaHCO3 25，Glucose 10，HEPES 10，pH7.4；使用前通氧气饱和。
（2）K通道标准细胞外液（mmol/L）：NaCl 130，KCl 5.4，CaCl2 2，MgCl2 1，Glucose 10，HEPES 10，pH7.3，使用前通氧气饱和；
（3）K通道电极内液（mmol/L）：KCl 120，CaCl2 1，HEPES 10，EGTA 10，Na2ATP 3，MgCl2 2，pH7.2，经0.22滤膜过滤。
2.2. 小鼠大脑皮层神经元急性分离
取出生10天左右的昆明小鼠迅速断头取脑，置于4°C人工脑脊液中，一分钟后将脑切成冠状切片，并继续切取皮层组织，厚度约为400左右，放入连续通95%O2+5%CO2混合气的人工脑脊液中，孵育50分钟。之后加入Pronase，其终浓度为0.36g / L，32°C下消化15min。消化结束用
人工脑脊液洗脑片3次，加入盛有人工脑脊
液的离心管中，用4根口径渐小的Pasteur吸管轻轻吹打组织块，制成细胞悬液，静置5min后取上部细胞悬液，放入带有盖玻片的培养皿内，约15～20min后细胞贴壁。分离完整的皮层神经细胞显微镜下观察，形态呈锥体或椭圆形，顶树突和轴突完整，细胞表面光滑，颗粒均匀细腻，它可在6～8小时内保持良好的生理状态[16-19]。
2.3. 全细胞膜片钳记录和数据分析
在25°C室温下，利用PC2C膜片钳放大器（华中科大）进行全细胞膜片钳记录，实验参数的设置、数据采集和刺激方式的施加均通过软件来控制，采样频率为100kHz。记录用玻璃微电极经两步拉制而成，充灌电极内液后，电极阻抗为1.5～3ΜΩ。当电极与细胞膜之间形成高阻封接（>1GΩ）后，将钳制电位调到-80mV，进行快电容补偿后，稍加负压破膜，使电极液与细胞内液相通，再进行慢电容和串联电阻补偿。
实验所用刺激装置由实验室自行研制，先将小鼠的皮层神经细胞分离和贴壁，而后再将得到活性状态较好的细胞放置于脉冲磁场当中，刺激后在进行膜片钳试验，最后将得到的数据和正常的进行对比研究，刺激过程如图1所示。
图1 脉冲磁场刺激示意图
Fig. 1 Schematic diagram of pulsating magnetic fields irradiation
实验结果分析采用Pclamp软件和Origin7.5统计软件完成，分析结果用Mean±SD表示，脉冲磁场刺激前后差异的显著性用单因
数方差分析和检验进行分析，P<0.05表示有统计学差异。
3. 结果
3.1. 瞬时外向钾通道电流(IA)的记录
采用上述标准细胞外液和电极内液，且在外液中加入1 TTX、0.1的CdCl2和20的TEA-Cl，记录皮层神经细胞膜上外向钾电流。置钳制电位于-80mV，给予脉冲幅度为-60mV～+50mV，脉冲宽度60ms，步幅+10mV的去极化脉冲刺激电压(图2A)，由于刺激频率与电流的强度大小没有直接关系[16]，因此此次实验采用统一的刺激频率为0.025Hz，对得到的数据进行处理。该激活的外向电流即为快速激活和失活的瞬时外向钾电流IA(图2B)。
(A)
(B)
(C)
图2 (A)刺激脉冲(B)记录的IA (C)曝磁后的IA
Fig. 2 Transient outward potassium current traces (A) Depolarizing steps (B) Transient outward potassium current traces（C）Transient outward potassium current traces after magnetic fields’ exposure
考察正常皮层神经细胞IA电流随时间变化的特点。给予图2A所示的去极化脉冲刺激，分别在1~6min记录不同时间的IA，可知IA在4min基本达到稳定。本试验分别采用加刺激与并未加刺激细胞第四分钟的IA电流进行比较。
3.2. 脉冲磁场刺激对IA时间依赖性的影响
给予与3.1相同的去极化脉冲刺激，分别对磁场照射25min和45min的IA进行记录，已知IA在4min基本达到稳定，数据记录应该从此时刻开始进行。为给予不同阶梯去极化脉冲刺激，经磁场作用25min和45min后的IA电流密度的曲线。由实验结果可知：细胞经过曝磁后，IA受到明显的抑制，对照组的最大电流密度为213.80±41.65pA/pF(n=9, P<0.05)，25min照射组最大电流密度为70.24±21.92pA/pF(n=6, P<0.05) ，45min曝磁组的最大电流密度为49.28±10.91pA/pF(n=6, P<0.05)。
图3 IA随时间变化I-V曲线
Fig.3Effects of magnetic field irradiation on transient outward potassium currents in different irradiating time. Activation potential of transient outward potassium channel began to shift towards more negative potentials after irradiating for 25 min and 45min (n=6).
3.3.脉冲磁场对瞬时外向钾电流曲线的影响
将未加刺激和加磁场刺激后得到的瞬时外向钾电流数据加以比较，其结果如图4所示。
以不同膜电位（去极化刺激电位）为横轴，该膜电位下激活的IA电流密度值（电流/膜电容）为纵轴，绘制通道电流的曲线（图4）。对照组和曝磁组的最大激活电流密度分别为213.80±41.65pA/pF、67.46±22.34pA/pF。由曲线可知，脉冲磁场可以抑制IA。并且经检验，对照组和脉冲磁场刺激组IA在统计学上具有显著性差异（n=10, P<0.05）。
图4 对照组、曝磁组IA的曲线
Fig.4 Transient outward potassium currents difference between the control and magnetic field irradiation
3.4. 脉冲磁场对IA稳态激活特性的影响
给予同3.1中相同的刺激方式，以第四分钟纪录的瞬时外向钾电流作为对照。利用公式将电流值转换成电导值，其中G为电导、为测试膜电位，为翻转电位，为不同膜电位下测定的电流峰值。以电导值与最大电导值的比值对应膜电位分别绘制脉冲磁场作用前后IA的稳态激活曲线（图5）。所得曲线可以用Boltzmann方程拟和，其中为半数激活电压，为曲线的斜率因子。由图5可以看出对照组与脉冲磁场组激活曲线均呈S型，并由此计算出对照组和曝磁组瞬时外向钾通道的半数激活电压分别为13.25±2.22mV和30.98±4.11mV（n＝6, P<0.05），斜率因子分别为24.00±2.05mV和23.30±2.13mV（n=6,P<0.05）。由此可知，脉冲磁场作用可明显改变IA的激活特性，使激活曲线向右移动，并不改变其斜率因子。
图5 对照组、脉冲磁场照射组IA的激活曲线
Fig. 5 Effects of magnetic field irradiating on steady-state activation kinetics of IA. Currents were elicited with a series of 160 ms step pulses from –60 mV to 50 mV (10 mV increment for each step). Each point represents mean±S.D. (n=6).
4. 结论
实验结果表明，频率为15Hz，强度为1.4mT,占空比位50%的脉冲磁场的作用，使小鼠皮层神经细胞膜瞬时外向钾通道电流IA受到一定的抑制。结果还表明，脉冲磁场的作用可使IA的激活曲线显著地右移，但其并不改变曲线的斜率因子。据文献[16]，神经细胞膜瞬时外向钾离子通道IA的激活过程受到抑制，会使得电压依赖性钾通道的开放延迟,抑制IA的激活过程而调节神经细胞的静息电位和兴奋性，延缓神经细胞的去极化过程，加速动作电位的产生。因此可知脉冲磁场作用皮层神经细胞可以改变其瞬时外向钾通道特性，从而影响动作电位的形成和发放频率，调节神经元的生理功能,有利于受损神经元的恢复和再生。
低频脉冲磁场对有机体的作用是一个非线性、瞬态的过程，主要集中在生物膜上。在中枢神经系统，由于对获取的信号存在放大机制，即便采用低频低能脉冲磁场，在毫微秒的瞬间使膜电位发生毫伏量级的细微改变，也可使神经细胞膜电位发生意义深远的变化。神经元的快速信号获取，是典型敏感的膜离子通道关闭或开往，控制膜内外的钠、钾、钙等离子转运。无论是膜两侧离子浓度比之的变化还是电荷穿越质膜迁移所携带的信息，都会改变细胞自身的生理和生化状态。但其具体影响的机理则需要进一步的工作去研究。
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