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氢气减轻猪心脏移植围手术期氧化应激【12】精选

已有 2342 次阅读 2024-3-8 09:00 |系统分类:科研笔记

氢气减轻猪心脏移植围手术期氧化应激

心脏移植现已成为治疗严重心力衰竭的常规方法。专注于预防缺血-再灌注损伤和减轻氧化应激对于取得成功的结果是至关重要的。然而，长时间的麻醉、高氧和除颤会导致活性氧/氮物质（ROS/RNS）的增加，并破坏氧化还原平衡，这是一个严重的风险因素。众多出版物已经确认了氢气显著的抗氧化、抗凋亡和抗炎特性。在我们的模拟心脏移植实验中，我们展示了在麻醉和体外循环（ECC）期间给予2%氢气能显著减轻氧化应激引起的损伤。这一点通过缺血标志物、脂质过氧化和炎症的显著减少得到了证明。植入猪心脏的泵血活动恢复情况有所改善，减少了反复除颤的需要。在移植物采集和移植期间给予氢气能显著增强移植心脏的功能和接受者的整体状况。通过常规通风机和ECC氧合器给予的氢气代表了一种创新疗法，可以显著改善当前的移植技术。

引言

心脏移植已成为末期心力衰竭的常规治疗手段。然而，在再灌注和复温后实现植入移植物的完全功能通常需要反复的电除颤冲击。心室颤动的关键短暂时期主要归因于在心脏缺血/再灌注（I/R）、麻醉和冷停跳后的除颤累积作用下自由氧/氮自由基的增加形成。I/R损伤和氧化应激已被确定为围手术期和术后不良事件的主要风险因素[1]。

缺血和再灌注：线粒体在代谢中扮演着至关重要的生理角色，通过为最佳细胞功能提供能量[2]。改变的心脏离子稳态和结构重塑与升高的活性氧物质（ROS）以及随后的氧化和代谢应激有关[3]。在缺血期间，线粒体氧化链受到损害，再灌注后ROS急剧增加[4, 5]。

移植物保存的黄金标准是冷保存的心脏停跳[6, 7]。心脏移植物的质量与冷缺血时间成正比，在理想条件下不应超过5-6小时[8]。为了从供体那里获得一个优质的心脏，快速心脏停跳仍然是心脏保护的黄金标准[1]。低温心脏停跳需要立即且持续的电机械静止、迅速的心肌冷却，以及添加某些治疗性添加剂。

麻醉对氧化应激的影响存在争议。根据一些作者的观点，挥发性麻醉剂如异氟醚和七氟醚可能通过调节与凋亡相关的基因显示出缓解缺血的有希望的效果，这反过来减少了细胞凋亡[5, 9]。然而，长时间暴露于2%的七氟醚可能会导致DNA损伤增加和谷胱甘肽含量降低[10]。

在麻醉过程中，过量的O2或高氧血症是众所周知的伤害因素。当活性氧物质（ROS）的形成超过了抗氧化防御时，就会产生氧化应激，从而引发毒性。术中高浓度氧气的管理可能会增加伤害，可能是通过增加氧化损伤和炎症，导致更多的并发症和更差的结果[11]。

反复除颤可能对心脏产生不良影响，并可能使移植的成功复杂化。强烈的除颤冲击可能会对心脏造成暂时性或永久性损伤。值得注意的是，弱的除颤冲击不会对心脏造成任何伤害，但也无法实现除颤。足够强度的电击以立即除颤会导致心室心肌显著的细胞破坏、钙调节的重大异常、氧化应激以及促炎和促纤维化过程的激活，这些都有助于收缩功能障碍[12]。

氢气的效果

氢气似乎是理想的选择性活性氧清除剂，特别是对于反应性极高的羟基和亚硝酰自由基。因此，H2可能有助于预防需要除颤的危险纤颤长时间发作。吸入氢气的使用已被报道为心脏移植中的有效保护剂[13,14,15]，并且已显示出包括在动物研究中抑制缺血/再灌注（I/R）损伤在内的各种生物效益[16,17,18,19]。

我们的假设是，给予氢气可以通过选择性清除羟基/亚硝酰自由基来减轻I/R损伤和其他氧化应激源，减少脂质过氧化和炎症，增加天然抗氧化酶。这反过来可以导致更少并发症的改善结果。在本文中，我们提出了一种创新方法来减轻氧化应激，这是影响移植结果的主要因素。我们利用模拟猪移植模型来消除免疫反应、去神经和移植物植入相关的时间及创伤等混杂因素的影响，允许我们主要关注氧化应激问题及其抑制。

材料与方法

实验使用了16-17周龄、体重55-60公斤且被视为性成熟的雌性猪（学名Sus scrofa f. domestica）。动物的护理遵循捷克国民议会第246/1992 Sb.号法案第16节关于防止虐待动物的法律，并进行了修订。在预药物治疗后，使用了全麻（静脉注射异丙酚、静脉注射氯胺酮、吸入异氟醚，± H2）。

实验动物分为三组：

1. 对照组（C），在给予氢气前从血浆中测量标记物。

2. 模拟心脏移植组（T），进行模拟心脏移植，

3. 在麻醉过程中全程给予富含氢的空气（T + H2）（空气中4%的氢气 + >40-50%的氧气）的移植组。

模拟移植从模拟心脏提取开始，心脏完全与身体分离（除了神经），但并没有切断和移除。心脏保留在胸腔内，存放在4°C的冰盐水中。下腔静脉和肺静脉被堵塞。升主动脉被堵塞，给予冷却至4°C的心肌保护液Custodiol 1000毫升（冷缺血停搏存储），并连接心肺转流（CPB）。出于实验目的，模拟移植（原位自体移植）有许多优点，如最小化创伤、消除抗原性和减少移植物植入时的缝合时间。

在整个实验期间，测量了麻醉中给予的氢气在动脉血中的浓度。所有呈现的结果都通过减去空白值来标准化。对给予的氢气浓度的第一次测量是在猪预药物治疗后立即进行（时间0）。在麻醉期间，每5分钟测量并记录一次动脉血中氢气的浓度。所有的测量都是由Unisense 氢气微探针（丹麦奥胡斯Unisense A/S）执行。

经过三小时的冷存储后，用温血对心脏进行再灌注。一旦温度达到30-33°C，心脏开始收缩。如果需要，对心脏进行除颤。当心脏的压力达到约80毫米汞柱，脉搏约100次/分钟，并且这些参数维持了60分钟后，取得最后的血液和组织样本，实验终止。

样本被分析用于：

l 炎症和组织损伤的标记物，

l 氧化应激损伤的标记物，

l 总connexin 43蛋白表达水平，

l 基质金属蛋白酶2和9的活性。

通过敏感酶评估进行低氧/缺血损伤的组织化学研究，并对心肌组织进行了电子显微镜研究。

统计分析

实验数据以均值±标准差表示。统计分析使用单向双尾ANOVA检验，随后进行Bonferroni事后分析（GraphPad Prism 7）。P<0.05被认为反映了统计学上的显著差异。

结果

氢气测量

在麻醉期间，每5分钟测量并记录一次动脉血中氢气的浓度。在连接到体外循环(ECC)之前，麻醉期间检测到的最高值为0.18 μM。在ECC中，氢气直接被输送到ECC机器的氧合器中，在那里氧气（40-50%）与空气中的4% 氢气混合，在整个心脏停跳的180分钟内，将输送的氢气浓度降低到大约2%。此时，心脏停跳30分钟后，动脉血中氢气的浓度降至0.169 μM，180分钟后降至0.144 μM（见图12.1）。再灌注期在将猪从ECC机器断开后持续60分钟。在此期间，动脉血中氢气的浓度降至0.103 μM（见图12.1）。

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图12.1整个实验过程中猪动脉血的氢气浓度。（n = 11）

组织损伤和炎症标记物

包括肌酸激酶、肌红蛋白和hs-troponin在内的组织损伤标记物，在没有氢气治疗的移植后显示值有非显著性增加。然而，加入氢气后，这些标记物有非显著性下降，并且在肌红蛋白的情况下，其值甚至接近对照水平。

实验猪的血浆中乳酸脱氢酶（LDH）活性在移植组中显著增加，而在氢气治疗组中观察到显著降低。

左心室组织中的核因子κ B（NF-κB）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平在移植组中显著增加，但在氢气治疗组中发现显著减少。

与对照和氢气治疗组相比，实验猪左心室组织中的髓过氧化物酶（MPO）水平在移植组中非显著增加（见表12.1）。

表12.1 组织损伤和炎症标记物

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氧化应激

血浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性水平在氢气治疗组中显示出统计学上显著的降低。然而，左心室组织中的SOD1蛋白水平表明移植导致了显著的上调，而氢气治疗使SOD1蛋白值恢复正常。

血浆中8-羟基-2'-脱氧鸟苷的水平在模拟心脏移植后显著增加，但在氢气治疗后观察到显著减少。

实验猪血浆中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性在氢气治疗组中显著降低。实验猪血浆中的丙二醛（MDA）水平在氢气治疗后显著降低。

血浆中的尿酸水平在移植后显示出统计学上显著的升高，随后在氢气治疗后几乎正常化。

在血浆中测量的过氧化氢酶活性水平在移植组中显示出统计学上显著的增加，并在氢气治疗后略有下降。

实验猪左心室组织中的Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）和核因子红细胞生成素相关因子2（Nrf2）水平在氢气治疗后没有变化（表12.2）。

表12.2 氧化应激标志物

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基质金属蛋白酶2和9

实验猪血浆中MMP2活性水平在未进行氢气治疗的移植组中显示出非显著的增加趋势，而氢气治疗具有正常化效果。心脏模拟移植显著增加了血浆中MMP9活性水平，而在氢气治疗后的活性增加较不明显。

实验猪左心室组织中的总连接蛋白（Cx）43水平在氢气治疗后显著增加。然而，实验猪左心室组织中的磷酸化Cx43和PKCε水平实际上没有变化（表12.3）。

表12.3 连接蛋白43、PKCε以及基质金属蛋白酶2和9

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组织化学结果

组织化学结果显示，糖原依赖性磷酸酶是缺血损伤的敏感标志物，在对照心肌中显示正常的均匀染色（图12.2A）。移植心脏显示出活性较低和斑驳染色的区域（图12.2B）。然而，经氢气治疗的移植心脏的心肌几乎显示出正常的均匀染色（图12.2C）。

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图12.2心脏组织的组织化学。代表性的糖原依赖性磷酸酶（缺血损伤的敏感标志物）染色切片的组织化学。A.正常对照心肌显示均匀染色，表明酶活性正常，B.移植心脏的心肌呈现斑驳染色，C.经氢气治疗的移植心脏的心肌几乎显示正常染色

无论是否给予氢气治疗，线粒体琥珀酸脱氢酶的活性都很高。然而，与正常对照心肌均匀染色（图12.2D）相比，移植并除颤的心脏的心肌显示出超收缩区域和增加的甲臜颗粒（图12.2E）[20]。在氢气治疗下，心脏组织的线粒体损伤较不明显，经氢气治疗的移植心脏的心肌几乎显示正常染色（图12.2F）。

电子显微镜

我们实验中的电子显微镜检查集中在左心室中层部分。比较左心室各层的损伤程度显示出一定的异质性，其中我们发现亚内膜层损伤最严重。我们关注中层心肌质量是因为心肌的中间质量在心脏功能中起主要作用。在实验结束时取得的组织样本的代表性结果（即经过3小时的心脏停跳低温保存，以及1小时的再灌注，最终以正常功能结束，无纤维颤动，达到80毫米汞柱的压力和大约每分钟100次的脉搏）显示，在给予氢气治疗后（图12.3B），与未使用氢气的移植组相比（图12.3A），线粒体、毛细血管内皮和肌膜的损伤表现明显减少，肌节收缩也较少。这些发现可能不仅表现为更好地管理氧化应激，而且在氢气已经被使用的实验中，除颤的使用频率也较低。

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图12.3心脏组织的电子显微镜检查。实验的电子显微镜检查集中在左心室心肌的中层部分。（A）移植心脏的心肌出现众多变化，主要是线粒体（m）的变化，但肌原纤维、闰盘（ID）、肌膜和毛细血管内皮细胞也出现了退化性改变。（B）经氢气治疗的移植心脏的心肌几乎显示正常的超微结构

讨论

尽管在心脏移植前收集和储存技术方面取得了进步，但心脏移植总是与紧张和不确定性相关，当接管其生理功能时更是如此（57）。

为了保护心脏免受缺血/再灌注（I/R）损伤，提出了多靶点假说以激活生存途径（存活因子增强 -RISK、存活因子增强 -SAFE、NO/PKG）以及抑制有害途径（炎症、线粒体/核DNA和DAMPS/PAMPS）[21, 22]。

由于之前的心脏保护方法专注于提高RISK、SAFE及其他途径的效力，我们的意图是指出增加的活性氧（ROS）形成和特别是氧化应激的已证实危险，并寻找其缓解方法，这给予细胞最佳的存活机会[21]。

在影响移植后心脏再灌注关键阶段和术后早期过程的各种因素中，活性氧和氮物质的过量产生是一个关键因素，可能会对顺畅的移植过程产生负面影响。

心脏移植是一个复杂的过程，涉及细胞、器官和整体水平的反应。在这个过程中的一个共同因素，包括其他因素，是氧化应激。考虑不仅是移植物的状况，还有氧化应激对整个机体的整体影响是很重要的。诸如麻醉、高氧和体外循环（ECC）等因素都会对身体造成的氧化应激产生影响。然而，游离抗氧化剂的给药已被证明是无效的（18）。

许多活性氧物种（ROS）对正常生理过程是必需的。因此，氢气，以其相对惰性而闻名，有选择性地清除侵略性的羟基和亚硝酰基自由基，使其成为减轻功能和结构异常的有希望的候选者[23]。

目前，关于吸入氢气的最佳浓度尚无共识。出于安全考虑，建议吸入的氢气浓度在与空气混合时应该监测并保持在4.6%以下，在与氧气混合时保持在4.1%以下[24]。在我们的实验中，我们使用了与空气混合的4% 氢气，通过麻醉设备进行吸入，其中加入了40-50%的O2，并且在ECC氧合器中使用了与40%-50% O2混合的相同浓度的氢气。这将使氢气的浓度降至接近2%的有效剂量。类似的氢气浓度也被其他治疗的作者用于吸入[25, 26]。

在实验的整个过程中，我们设法将动脉血中的氢气水平维持在0.1到0.18微摩尔之间。这是通过在麻醉期间吸入氢气、用氢气对血液进行氧合以及在体外循环(ECC)氧合器中实现的。然而，根据亨利定律，2%的氢气浓度应该提供大约14.2微摩尔的血浆浓度。因此，我们的测量结果与预期值相差近10倍。这可能是由于仪器/方法学中的系统误差或其他因素造成的。这将在未来的研究中进行调查。提到的约2% 氢气与40-50% O2的给药方式确保动脉血中含有足够的氢气量以减少机体的氧化应激。

在我们的实验中，我们选择了移植损伤和全身氧化应激的标志物。使用氢气后，这些标志物接近正常水平，表明其在保护移植物和整个机体方面具有积极作用。这种预防效果优化了心脏的功能和术后恢复期。

未进行氢气治疗的模拟移植显著增加了肌钙蛋白和肌酸激酶的水平，这表明心肌细胞死亡或损伤。这两个标志物在使用氢气治疗后降低。血液血浆中的组织损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)在未进行氢气治疗的移植后显著增加，但在使用氢气治疗后显著降低，表明机体状况有所改善。炎症标志物核因子-kappa B (NF-κB)和肿瘤坏死因子-alpha (TNF-α)在移植后增加，但在使用氢气治疗的心脏中显著降低，这表明在移植功能恢复后不久条件得到改善[27]。

还测量了血浆中的氧化应激标志物。观察到丙二醛（脂质过氧化的标志物）、8-羟基-2'-脱氧鸟苷8-OHdG（DNA损伤的标志物）、谷胱甘肽过氧化物酶、尿酸和过氧化氢酶的水平，在使用氢气的组别中与未使用氢气的移植相比都显著降低。这表明当应用氢气时，整个机体的整体氧化还原状况有所改善[23]。

据报道，尿酸（UA）贡献了血液中>50%的抗氧化能力（28）。然而，目前还没有共识UA是保护性还是风险因素。尽管如此，似乎急性升高是一个保护因素，而慢性升高则是疾病的一个风险[28]。Xie等人[29]展示了在预防肾脏损伤方面的保护效果，并且可以在缺血再灌注(IR)损伤后抑制肾纤维化。

超氧化物歧化酶-1（SOD-1）（它催化超氧阴离子转化为氧气和过氧化氢）在左心室组织中，在使用氢气的组别与未使用氢气的移植相比显著降低。尽管两组与对照组相比都有SOD1水平升高，但氢气组的SOD1水平较低，再加上氧化应激标志物水平的降低，表明在移植心脏中使用氢气可以改善抗氧化状态[30]。

基质金属蛋白酶（MMPs）在实验猪的血浆中降解并沉积基质和非基质蛋白，并显示出促纤维化情况的迹象[31]。MMP2在未进行氢气治疗的移植组中显示出非显著的增加趋势，并且在氢气治疗后表现出正常化效果。然而，MMP9活性在实验猪的血浆中显示出由心脏模拟移植引起的MMP9活性显著增加作为促纤维化情况的标志，而在氢气治疗后的活性增加较不明显[31]。

在心脏生理学中，电激活是一个关键现象。动作电位通过间隙连接蛋白（Cx）通道从一个心肌细胞传递到另一个心肌细胞，而Cx43是一种普遍存在的心脏同种型。Cx43的表达及其功能性磷酸化状态是高度动态的，并对病理生理条件做出响应。虽然Cx43的下调对心功能有害[32]，但上调可能是有益的。我们的实验表明，Cx43对于心脏结构的形成和细胞间通讯至关重要[33]。在目前的实验中，总连接蛋白43（TCx43）的蛋白质表达水平增加表明细胞间通讯增强，并且在添加氢气后心律失常的倾向减少。

糖原磷酸化酶在心脏植入并恢复正常功能后的冷冻切片上得到证明，是一个非常敏感的缺氧/缺血指标，实际上反映了心肌中糖原含量的减少[34, 35]。同样，琥珀酸脱氢酶不如前一个反应敏感，但它可靠地显示了线粒体损伤，这表现为更大的甲臜颗粒。基于我们的结果，组织化学反应清楚地表明，在氢气治疗的动物中，心肌组织得到了更好的保护。也发现了超收缩病灶，但除了钙代谢紊乱外，它们还可能由除颤期间更频繁和重复的电击引起[36]。

我们对实验中心脏组织的电子显微镜检查集中在移植心脏左心室的亚内膜、中层心肌、亚外膜和尖端部分。最显著的变化发现在线粒体以及肌节、闰盘（ID）、细胞膜和毛细血管中。从接受氢气治疗的移植心脏中取得的样本显示出显著改善的超微结构。我们的超微结构结果与其他作者的结果一致[37, 38]。

基于我们呈现的结果以及其他作者选定的结果，看来在整个实验中使用氢气具有保护作用，并改善了移植的结果。以下观察支持了这一点：（i）氢气减轻了与移植相关的缺血-再灌注损伤；（ii）氢气在麻醉过程中防止了高氧和活性氧（ROS）的形成；（iii）氢气在移植后除颤过程中保护了心脏免受损害；（iv）氢气管理减轻了心脏移植中的氧化应激，改善了总体结果；以及（v）在麻醉过程中添加4%的氢气减少了氧化应激、缺血标志物、炎症和过氧化。总的来说，氢气管理改善了心脏形态，减少了室颤的严重性，并在猪心脏经历3小时冷缺血和1小时温血再灌注后提高了心脏泵血活动。

综合来看，氢气治疗可以被视为一种新颖、有效和全面的策略，成功消除氧化应激的影响，并显著改善心脏移植的结果。此外，这些结果为设计旨在测试这种策略效果的临床试验提供了理由。具体来说，向在移植手术中经历缺血-再灌注事件的心脏和其他器官（如肾脏或肝脏等）的患者施用氢气。

本内容来自《氢气与疾病健康》12章