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代谢学人--Science子刊：肌肉基因突变效果男女大不同
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代谢学人
Science子刊：肌肉基因突变效果男女大不同
撰文 | 刘诗鸣 刘秀玉 姚静 张俊 郭明伟 朱爽爽
编辑 | 孟美瑶
欢迎大家准时收看新一期的文献精读~
遗传因素对优秀运动员的运动能力有重要影响
“金牌基因”ACTN3与人体肌肉的爆发力有关
而该基因缺失会导致肌肉质量减少
从而影响运动员正常发挥
令人意外的是
ACTN3竟可以减缓雌性小鼠中
地塞米松引起的肌肉萎缩
这到底是怎么回事呢？
快来看看吧！
背景介绍
ACTN3纯合多态性缺失(ACTN3 577X纯合突变)导致全球超过 15 亿人完全缺乏ACTN3。当ACTN3基因第1747位C突变为T时， ACTN3蛋白第577位精氨酸就会形成终止密码子，导致ACTN3蛋白的表达缺失。若个体的基因型为577X纯合子 (ACTN3 577XX)时，则会造成ACTN3缺乏，这与精英运动员和普通人群的短跑和肌肉力量显著降低有关。但是在正常的生理状态下，ACTN3的缺失并不会导致明显的肌肉缺陷，这可能是由于在骨骼肌中存在的与ACTN3高度同源的ACTN2产生的代偿性作用引起的。同时，ACTN3的缺失还与老年骨骼肌质量持续减少有关，其增加了老年人肌少症、虚弱和功能丧失的风险。在对两个大型白人绝经后妇女（每个群体 n >1200）独立群体的病例对照分析显示， ACTN3 577X 等位基因的携带会使跌倒风险增加33%。最近一项针对中国老年人群（70至79岁，n=1031）的研究也显示，ACTN3的缺失会导致老年人力量的缺失和虚弱风险的增加。另外，ACTN3 突变基因型（如ACTN3577X和ACTN577XX）可以改变各种慢性疾病的临床严重程度如麦卡德尔氏病、肌炎、庞贝病和杜氏肌营养不良症 (DMD) 等肌肉疾病的发病和进展程度。ACTN3 基因型也与充血性心力衰竭患者的存活率相关，携带X等位基因的患者的死亡率是 ACTN3 577RR基因型（小编注：577RR是野生型表示在577位的等位基因为精氨酸，前面所提到的577X表示577位的精氨酸R突变后，形成了终止密码子）患者的1.72倍（P = 0.01）。
ACTN3 敲除小鼠模型的表型分析为ACTN3缺乏对骨骼肌特性和功能的影响提供了机制解释。与野生型 (WT) 同窝小鼠相比，ACTN3 KO小鼠肌肉中2型肌肉（快速收缩的白肌纤维）显著减少、快收缩糖酵解型肌纤维面积显著降低、厌氧相关功能活性降低和氧化磷酸化水平增加。（ 小编注：骨骼肌由快肌纤维与慢肌纤维组成。红肌纤维也叫I型纤维、慢缩肌纤维、慢氧化纤维；白肌纤维又称II型纤维、快缩肌纤维或快解醣纤维。在功能上，I型肌纤维氧化能力高，最不易疲劳，糖酵解能力低，收缩速度慢，典型红肌，毛细血管密度高，线粒体浓度高、细小，运动单位力量低，但持久，适合于维持平衡和姿势的功能；II型肌纤维包括IIa型、IIX型和IIb型，其中，IIa型肌纤维既能有氧代谢，不易疲劳，又能糖酵解供能，快速收缩，毛细血管密度中等，线粒体浓度中等，运动单位力量高，适合持久的快速运动。IlX型肌纤维氧化能力低，易疲劳，糖酵解能力最高，收缩速度快，运动单位力量高，具有持续保持张力和维持姿势的稳定性作用。IIb型肌纤维缺少有氧代谢，易疲劳，通过无氧糖酵解供能，收缩速度快，典型白肌，毛细血管密度低，线粒体浓度低、宽大，运动单位力量高，但不持久，适合于短时爆发快速运动。）这种快速糖酵解肌纤维代谢特性的“减慢”是由糖原磷酸化酶活性降低所驱动的，且在出生后通过回补或替代骨骼肌中的ACTN3可以逆转这种“减慢”反应。ACTN3缺陷的快肌纤维也表现出钙调神经磷酸酶（RCAN）活性的增加和收缩特性的改变，其原因是肌浆网钙泄漏增加和肌浆/内质网钙ATP酶1(SERCA1)、肌集钙蛋白（calsequestrin）和肌钙腔蛋白（sarcalumenin）表达上调而引起的钙信号的改变，而钙信号在骨骼肌的生长发育中起重要调控作用，上述ACTN3 KO小鼠肌肉中钙信号蛋白的改变导致了骨骼肌中快肌纤维的减少。
ACTN3缺乏是如何影响基本肌肉质量（muscle mass at baseline）和对萎缩性刺激做出反应的尚未完全清楚。过往研究表明，与WT小鼠相比，ACTN3缺失小鼠通过升高RCAN活性，调控后肢固定化和去神经引起的肌萎缩和肌纤维类型转换的改变。尽管RCAN依赖性通路与肌肉生长和适应功能超负荷有关，但ACTN3也直接与可溶性信号因子、磷脂酰肌醇3-激酶p85(PI3Kp85)、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸和磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸相互作用。以上这些因素可以驱动下游通路并对许多细胞功能进行调节，包括调节蛋白质合成的PI3K/Akt/mTOR（雷帕霉素作用机制靶点）信号级联反应和胰岛素样生长因子1（IGF1）介导的肥大反应。在心肌细胞Z盘（小编注：Z盘是心肌细胞中产生收缩力的最小单元肌节的分界线，能横向传导收缩力）中，α-辅肌动蛋白-2也与在肌肉萎缩期间上调的Atrogin-1 (Fbxo32，一种 E3 泛素连接酶) 相互作用。总之，这些数据表明ACTN3缺乏通过修饰与蛋白质合成和降解相关的关键信号分子来调节肌肉质量。
糖皮质激素通常用于治疗与慢性炎症相关的各种疾病，如DMD，但也会导致肌肉萎缩和骨质疏松等不良反应。在骨骼肌中，糖皮质激素通过泛素-蛋白酶体和自噬溶酶体系统增加蛋白质分解代谢速率，并在翻译水平抑制蛋白质合成，从而引起快肌纤维萎缩。越来越多的生化证据表明α-辅肌动蛋白家族成员在调节糖皮质激素受体(GR)的活性中发挥作用，这增加了ACTN3缺乏可能改变骨骼肌对糖皮质激素治疗的反应的可能性。ACTN4在糖皮质激素地塞米松存在的情况下，通过核受体相互作用基序LXXLL（小编注：该基序在所有α-辅肌动蛋白家族蛋白中都是保守的，并呈剂量依赖性增强GR活性）与GR相互作用。同样，ACTN4和ACTN2（与ACTN3 80%相同）通过LXXLL基序直接与雌激素受体、雄激素受体和甲状腺受体等其他核受体相互作用并促进其活性。ACTN2还与GR相互作用蛋白(GRIP1)结合，增加其反式激活活性，并协同增强其核受体共激活因子功能。这些结果表明，ACTN3的缺乏可以增加α-辅肌动蛋白-2的代偿性表达，同样可能改变骨骼肌中GR的活性和对糖皮质激素的反应。
本研究旨在检测ACTN3缺乏对成熟骨骼肌及发育过程中与蛋白质合成和降解相关通路的影响，进而判断其是否影响地塞米松诱导的肌肉损失。本文使用ACTN3 KO小鼠模拟人群中ACTN3 577XX造成的ACTN3缺乏。结果表明ACTN3缺乏对肌肉质量和下游mTOR信号的作用时期在出生后发育早期到完全肌肉成熟之前。研究进一步证明ACTN3缺乏可减缓地塞米松诱导的肌萎缩反应，ACTN3直接影响地塞米松处理后与肌肉应激和炎症反应相关的关键基因和通路的表达。最后，研究表明ACTN3缺乏可以通过增加蛋白质合成和减少肌肉萎缩相关基因表达来减缓雌性小鼠 (而不是雄性小鼠) 中地塞米松引起的肌肉萎缩反应。
研究结果
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1、ACTN3缺乏从出生后早期发育开始改变肌肉质量和蛋白质合成/分解的信号通路
在发育、再生和抗阻训练诱导的肌肉肥大过程中，负责肌肉生长的信号通路汇聚于mTOR及其下游控制蛋白合成的调控元件上。由于出生后的前3周是小鼠肌肉纤维数量增加(增生)和肌纤维大小增加(肥大)的高度生长时期，文中通过在出生后0天（P0）， 7天（P7）, 14天（P14）和28天（P28）检测PI3K/Akt和Smad3来表征mTOR的激活，PI3K/Akt和Smad3可介导肌生成抑制素/激活素A信号，并通过Akt与mTOR信号发生交流。因为曾在成熟的α-actin-3缺乏的骨骼肌中观察到钙调神经磷酸酶（RCAN）活性提高，因此研究人员还对RCAN1-4在上述发育时间点的表达进行了检测，并以此来作为钙调磷酸酶活性的标志。WB结果显示，尽管ACTN3 KO小鼠肌肉与WT相比磷酸化mTOR ( p-mTOR )和mTOR显著降低(图S1 )，但在P0时不同基因型间通路的激活并没有显著差异，即在P0的时候ACTN3 KO相较于WT还未出现蛋白质合成相关基因的显著差异。在P7时，ACTN3 KO小鼠肌肉再次显示p-mTOR和mTOR降低，4ebp1和p-4ebp1及PI3K p85也同样降低；Akt、p- Akt、Smad2 / 3、p- Smad3、S6RP、p-S6RP的表达在基因型间并无差异，这说明在P7的时候ACTN3 KO相较于WT出现部分与促进蛋白质合成相关的基因下调。
与WT相比，ACTN3KO肌肉中RCAN1-4表达增加(图1A和图S2A )。相比之下，在P14时，ACTN3KO肌肉中mTOR活性和总4ebp1相比WT有所增加，而p-4ebp1却没有增加；同样，PI3Kp85和RCAN1-4在ACTN3 KO肌肉中的表达也有所增加(图1B和图S2B )，所以在P14时ACTN3 KO相较于WT而言促进蛋白质翻译的总4ebp1上升但是真正发挥作用的p-4ebp1却没有增加，蛋白质合成并未增强。在另一方面也佐证了这一点，与WT相比，ACTN3 KO小鼠肌肉在P14时也观察到Smad3激活增强，提示蛋白质合成的抑制，且在P28 (图S3 )，以及成年雄性和雌性小鼠的骨骼肌中也有类似的趋势(图1C和图S4 )。综上，ACTN3缺失是从出生后早期发育时开始改变PI3K/Akt/mTOR等与肌肉质量和蛋白质合成、分解相关的信号通路，其主要起到抑制骨骼肌蛋白质合成的作用。
拓展阅读
肌肉生长的调控
人体内有两条负责控制骨骼肌生长主要信号通路，分别是正调控肌肉生长的IGF1-PI3K-Akt/PKB-mTOR通路和负调控的myostatin-Smad3通路。IGF1-PI3K-Akt/PKB-mTOR信号通路广泛存在于多种细胞中，发挥调控细胞mRNA翻译、核糖体合成、细胞凋亡等多种生物学功能，从而影响细胞生长、增殖和分化过程。胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质，在人体肝脏和纤维细胞中合成，在调节细胞增殖和分化中起重要作用，对多种组织细胞的凋亡起保护作用。磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（phosphoino-sitide-3-kinase，PI3K）是一个细胞内磷脂酰肌醇激酶家族，PI3K家族成员可分为3种，即Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类，仅Ⅰ类PI3K家族成员负责生产PIP2和PIP3，其为IGF1的一个下游作用信号。Akt又称蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是丝氨酸/苏氨酸-特殊蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起基础作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidy linositol kinase-related kinase, PIKK)蛋白质家族成员。mTOR进化上相对保守，可整合营养、能量及生长因子等多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程，在细胞生长和凋亡中发挥极为重要的作用。
mTOR主要通过磷酸化其下游靶蛋白40S核糖体S6蛋白激酶(p70 ribosomal protein S6 kinases, p70S6K)，如S6K1，及真核启动因子4E结合蛋白1 (eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,4ebp1)来调节下游蛋白质翻译。活化的 S6K1 可磷酸化下游底物，如40S核糖体蛋白S6(p70S6)等，从而促进延长因子-1a(elongationfator-1a, EF-1a)、poly(A)结合蛋白等蛋白质翻译及表达。4ebp1通过与eIF4E（eukaryotic initiation factor 4E，真核起始因子4E，一种帽结合蛋白，可以特异性地识别mRNA的5'端的帽子结构，在真核翻译的起始过程中发挥重要作用）结合使eIF4E的活性受到抑制，进而抑制蛋白翻译的起始，4ebp1磷酸化促使两者分离，失去对eIF4E的抑制作用，进而促进蛋白质的翻译的起始。
肌肉生长抑素（myostatin）和激活素A（activin A）是转化生长因子-β(TGF-β)家族中的一个亚类，在骨骼肌生物学领域具有重要意义。其通过与激活素II型受体(ActRIIA或ActRIIB)结合，然后招募和激活I型受体(ALK4或Alk5）并通过Smad2/3转录因子抑制促蛋白合成的AKT-mTOR信号，限制肌肉生长。在另一方面，肌肉生长抑素或激活素A的表达对与Akt/mTOR活性相关的合成代谢信号也有抑制作用。
[1]Stefano Schiaffino, et al. FEBS Journal. 2013,280(17)
钙调磷酸酶calcineurin (RCAN)
RCAN是一种钙调素依赖的真核丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。它是一个异二聚体蛋白，由一个催化亚基RCAN-α和一个紧密结合的，肉豆蔻酰基化的RCAN-β组成。从酵母到哺乳动物，这两个亚基和异二聚体四元结构的一级序列都是高度保守的。RCAN作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，参与许多细胞过程和依赖于Ca2+的信号转导途径。
近年来RCAN被认为是感应骨骼肌Ca2+信号调控骨骼肌肥大的关键中介分子。RCAN及其下游转录因子活化T细胞核因子(NFAT)在I型和IIa型肌球蛋白重链(Mhc)的激活中起重要作用，通过减少肌肉生长抑制素的表达和改变其他未知靶点的表达，氧化酶和肌营养因子A基因以及肥厚反应。RCAN也通过肌细胞增强因子2 (MEF2)依赖的转录作用。在NFAT和MEF2信号被激活的同时，其他细胞内信号也被激活以影响生长。这些信号是由膜去极化、收缩负荷或生长因子的释放触发的，如胰岛素样生长因子1(IGF-1)，它通过Ras/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶和Akt/蛋白激酶促进肌肉肥大。
参考文献：
[1] MichelRN, et al . Proc Nutr Soc. 2004 May;63(2):341-9.
[2] TuMK, et al. Cell Calcium. 2016 Mar;59(2-3):91-7.
图S3.雌雄WT和ACTN3 KO股四头肌P28时PI3K / Akt / mTOR和Smad3信号的WB结果
之前的研究表明，ACTN3缺乏与成年小鼠肌肉质量减少有关。为了确定发育过程中ACTN3缺乏引起的蛋白质合成变化与ACTN3基因型对肌肉质量的影响在发育时间上的相关性，研究人员检测了WT和ACTN3 KO小鼠发育过程中的股四头肌质量。考虑到窝产仔数（little sizes）的差异，基因型间肌肉质量比较采用肌肉质量归一化到体重。在P14的小鼠中未检测到肌肉质量相对于体重的基因型差异，而在P28的小鼠中雄性和雌性小鼠均有显著差异(图1D )，结果显示骨骼肌中蛋白质合成随时间发生变化，且这种由于发育时间产生的骨骼肌质量差异的变化是早于ACTN3缺失而对骨骼肌质量产生的变化的。
（小编注：小鼠在出生后前28天是蛋白质合成和骨骼肌发育的最为快速时期，文中对P7 P14 P28不同发育时期的小鼠检测结果显示，在出生后28天内这样一个骨骼肌高速发育的时期无论是WT小鼠还是ACTN3KO小鼠蛋白质的总体合成趋势都是激活的，只是ACTN3小鼠在P14期抑制蛋白质合成的samd3也开始激活，在促进蛋白质合成和抑制蛋白质合成均存在的情况下，ACTN3小鼠骨骼肌也发育了，但是骨骼肌的发育状态不如WT鼠，显示出了肌少症。是先出现的骨骼肌发育合成再出现的抑制合成的smad3信号，所以由于发育时间产生的骨骼肌质量差异的变化是早于ACTN3缺失而对骨骼肌质量产生的变化）。
图S4.成年雌雄WT和ACTN3 KO股四头肌蛋白质合成和分解信号分析
为了进一步检测这些与ACTN3缺乏相关的信号变化对成年骨骼肌肌肉质量调节的影响，研究人员采用了非同位素表面翻译感应（nonisotopic surface sensing of translation，SUnSET )技术对WT和ACTN3 KO肌肉在体内的蛋白质合成速率进行了比较。30min以上的嘌呤霉素掺入量（puromycin incorporation）结果表明雄性小鼠ACTN3 KO。以下文中使用了成年小鼠，包括4月龄、10月龄、12月龄）肌肉蛋白质合成速度增加。
（小编注：虽然这里的嘌呤霉素渗入实验显示合成增加，但是在ACTN3 KO小鼠中P14就出现且维持到肌肉发育成熟的促进肌肉消耗的Smad3在持续激活，导致ACTN3 KO小鼠虽然嘌呤渗入更多了，但依然相对于WT小鼠表现出更多的肌肉消耗的趋势。(图 1E)，而雌性小鼠则未达到显著差异(图S4)。）
除了蛋白质合成，在蛋白质降解方面，研究人员还对自噬和泛素-蛋白酶体系统的标志物进行了检测，发现自噬标志物LC3A和LC3B的表达无基因型差异(图1F)；然而，与WT相比，ACTN3 KO肌肉中的Fbxo32 (编码E3泛素连接蛋白atrogin-1)和Trim63 (编码肌肉特异性RING指蛋白1 MuRF1 )显著下调，Fbxo32和Trim63作为泛素-蛋白酶体系统的标志物，其下调说明了成年ACTN3缺失雄鼠骨骼肌更能抵抗不良环境中诱导的肌萎缩的表型。(图1G)。
上述结果综合表明ACTN3缺乏在出生后肌肉发育早期影响肌肉质量和蛋白质的合成与降解，并且这些信号通路的改变可维持到骨骼肌发育成熟之后得到仍然发挥作用。
（小编注：ACTN3 KO小鼠相对于WT小鼠而言，持续激活的Smad3在P14就出现且维持到肌肉发育成熟这促进了肌肉消耗，（主要是II型纤维的损失），但是由于与ACTN3高度同源的ACTN2的代偿作用在成年个体中并不会表现出明显的肌少症表型, 且ACTN3 KO小鼠中肌萎缩基因Fbxo32 和Trim63的下调提示ACTN3 KO这样的无明显表型的个体更能抵抗严重的肌萎缩，引发下文对ACTN3 KO小鼠更能抵抗Dex诱导肌萎缩的研究。）
图1.α-Actin-3缺失从出生后早期开始改变骨骼肌蛋白质合成和分解信号
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为证实蛋白质合成和降解信号的变化能否影响ACTN3缺乏对肌肉萎缩的反应，研究人员对雄性WT和ACTN3KO（4月龄、10月龄、12月龄）小鼠腹腔注射地塞米松(20mg/kg)以激活肌肉萎缩信号，并在注射后3小时和24小时检测转录物的表达。之前的研究表明ACTN3影响GR活性，为了排除GR的干扰影响，文中首先通过RT-PCR评估GR激活后WT和ACTN3 KO肌肉中GR靶基因（upstream GR target genes）的转录表达，结果表明地塞米松处理(WT-Dex和KO-Dex) 3小时后GR靶基因Ddit4、Klf15和Fkbp5以及Foxo1和Foxo3的表达均显著增加了(图2A)，且其中除Fkbp5外大多数基因的表达没有基因型上的差异，而Fkbp5在ACTN3 KO肌肉中相对于WT肌肉始终表现出较低的表达。
拓展阅读
地塞米松让肌肉“松松”
地塞米松(Dexamethasone)又名氟美松、德沙美松、氟甲强的松龙，是一种人工合成的糖皮质类激素。长期或高剂量使用地塞米松可引起肌肉萎缩和骨质疏松，具体表现为纤维横截面积减少和肌原纤维蛋白含量减少。并且存在纤维特异性，即Ⅱ型纤维选择性萎缩，以Ⅱb型纤维萎缩最为突出，而Ⅰ型肌纤维较少受到影响。
地塞米松主要通过促进肌肉组织的蛋白质分解和抑制肌肉组织蛋白质合成来诱导肌肉萎缩。在蛋白质分解中，地塞米松激活泛素-蛋白酶体途径（UPS）和溶酶体自噬途径，从而激活蛋白质的分解代谢，其中叉头转录因子（forkhead box class O，FoxO）家族起到了重要作用。FoxO3可激活自噬基因表达，如Bnip3（一种线粒体促凋亡蛋白，与Bcl-2蛋白结合，进而促进细胞凋亡、引起线粒体去极化和自噬）和LC3（微管相关蛋白1轻链3，参与自噬泡的形成）来激活溶酶体途径，进而促进骨骼肌蛋白质降解。另一方面，FoxO1/3可以促进两种E3泛素连接酶的表达，即肌肉特异性环指蛋白-1（MuRF-1/Trim63）和肌肉萎缩F盒蛋白（MAFBx/Atrogin-1/Fbxo32），进而促进UPS蛋白质降解途径，最终导致肌萎缩。在蛋白质合成中，地塞米松对肌肉蛋白合成的抑制作用主要与mTOR/S6K1的活性有关。而一些糖皮质激素的下游靶标能直接影响mTOR的活性。①肌肉生长抑制素 (Myostain) 是肌肉质量的负调节因子，其通过抑制Akt-mTOR-S6K蛋白合成途径，从而抑制肌肉生长和分化。②Kruppel样因子15(KLF-15)是一种转录因子，其可抑制mTOR活性，从而抑制骨骼肌蛋白质合成。此外，KLF-15还可促进MuRF1和MAFbx的转录，从而促进骨骼肌蛋白质分解。③DNA损伤诱导转录因子4(DDIT4/REDD1)，也是一种mTOR的负调节基因，在细胞应急状态下可抑制mTOR活性。
参考文献：
[1]Shen S, et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2019;10(2):429-444.
[2]首健,等.中国药理学通报,2019,35(05):602-606.
[3]Katiyar S, et al. EMBO Rep. 2009;10(8):866-872.
尽管在地塞米松注射后3小时和24小时引发的GR靶基因变化很类似，但是在注射地塞米松24小时后ACTN3 KO小鼠肌肉中Fbxo32（即Atrogin-1，高表达则肌萎缩上调）的表达并未显著增加，而WT-Dex小鼠肌肉相对于注射生理盐水的小鼠（WT-Sal）肌肉，Fbxo32转录物表达增加约4倍(图2B)。这提示ACTN3KO小鼠对Dex诱导的肌萎缩存在一定的抵抗作用。进一步研究发现，与各自的生理盐水对照组相比，在注射地塞米松3h时检测肌萎缩相关基因trim63（（即MuRF1，高表达则肌萎缩上调））均升高了，但是在注射24h后可以看出ACTN3KO小鼠的肌萎缩基因显著被抑制了(图2C)。这些结果表明：不同基因型（ACTN3 KO/WT）对地塞米松诱导的Fbxo32(P=0.029)和Trim63(P=0.007)反应有显著影响，ACTN3 KO小鼠对地塞米松诱导的肌萎缩相关蛋白质降解信号反应较弱，即ACTN3 KO小鼠对Dex诱导的肌萎缩存在抵抗作用。
接下来进一步评估促进蛋白质合成的mTOR主要下游效应物的表达。结果表明，在地塞米松注射后24小时，与WT-Sal相比，WT-Dex肌肉中p-S6RP、S6RP和p-4ebp1的显著下调(图2D)，这与地塞米松处理抑制骨骼肌蛋白质合成信号一致。而与KO-Sal相比，KO-Dex肌肉在这些标记的表达上没有明显变化(图2E)。所以，ACTN3 KO小鼠比WT小鼠更能抵抗注射地塞米松带来的肌萎缩基因上调和蛋白质合成相关基因下降这样的不良影响。
图2.WT和ACTN3 KO小鼠对地塞米松的急性反应
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3、单次注射地塞米松后WT小鼠和ACTN3 KO小鼠肌肉的整体基因表达变化
为研究体内ACTN3基因型影响的注射地塞米松3小时和24小时后的急性整体基因表达变化，作者进行了常规转录组学分析（unbiased transcriptomicprofiling）。（小编注：本文使用 Benjamini 和 Hochberg 校正（q 值）控制多重比较的错误发现率。对于q <0.05 和倍数变化 >2 的基因被认为是差异表达基因。）对筛选处理后的数据进行多维度分析，发现按基因型、地塞米松处理和地塞米松处理后时间分组确实形成了有规律的基因表达的变化。进一步针对治疗效果、注射后时间、基因型和基因型与前一因素的相互作用进行差异表达分析，结果显示一共检测到8653个q<0.05的差异表达基因，其中q<0.05且倍数变化大于2的基因被认为是显著差异基因共有1416个，而且转录组分析结果表明ACTN3 在KO小鼠是成功敲除。（小编注：p-value：衡量一次检验假阳性率的指标（False positive rate）；q value：衡量错误发现率的指标（False discovery rate，简称FDR，所有检验中假阳性的概率）。即使用Q value的这个参数预估FDR。Q value 需要利用公式从p value 校正计算后得到，所以Q value 通常又被称为adjusted p value。一般情况下：我们可以认为Q value = FDR = adjusted p value，即三者是一个东西。）
热图结果显示：其中基因表达发生显著变化的共有1416个基因，在WT和ACTN3 KO小鼠中，地塞米松注射3小时的转录变化影响最为显著(图3A)。火山图分别显示了地塞米松处理(图3B)后的差异表达基因和ACTN3 WT和KO(图3C)影响的差异表达基因变化。进一步通过相关性分析结果发现，虽然在地塞米松处理后3小时和24小时后，WT和ACTN3 KO小鼠对地塞米松处理具有类似变化(图3D)，但是通过Pearson相关系数对ACTN3的基因型和地塞米松影响的交互作用分析显示，ACTN3 KO小鼠对地塞米松的反应存在特异性的差异表达基因，其中包括了5个特别的基因[Tmem100(q=0.00623)、Cbx8(q=0.049)、Mras(q=0.049)、2310022B05Rik(q=0.0550)、和Mstn(q=0.1238)]，且这些基因与肌肉生长与消耗或免疫表型相关的信号转导途径有关。
进一步的基因富集分析显示了ACTN3基因型对地塞米松的总体反应(图3F)，结果表明：地塞米松产生的效应与“细胞外渗的调节”、“单核细胞趋化的调节”和“细胞防御反应”等免疫反应相关与相关，而ACTN3基因型效应则与“肌肉适应”和“肌肉萎缩”相关。进一步分析显示， ACTN3基因型对地塞米松的反应也存在不同发育时间性的差异，这种差异主要体现在淋巴细胞迁移和肾上腺素受体信号上。WT和ACTN3 KO的“淋巴细胞迁移的正向调节”的对比图(图3G)表明在没有ACTN3的情况下，骨骼肌对地塞米松的免疫抑制反应减弱。总之，上述结果进一步证明了ACTN3 KO可以缓解肌肉中地塞米松诱导的肌肉萎缩反应。
拓展阅读
相关性分析：研究现象之间是否存在某种依存关系，对具体有依存关系的现象探讨相关方向及相关程度。可以分析包括变量间的关系情况以及关系强弱程度等。描述两个变量是否有相关性，常见的方式有3种：
1.相关图（典型的如散点图和列联表等等）
2.相关系数
3.统计显著性
相关系数常见有三类，分别是：Pearson相关系数、Spearman等级相关系数、Kendall相关系数。最常使用的是Pearson相关系数；当数据不满足正态性时，则使用Spearman相关系数，Kendall相关系数用于判断数据一致性。
图3.对WT和ACTN3KO雄性小鼠在注射生理盐水或地塞米松3或24小时后的四头肌进行转录组分析
4、急性地塞米松处理增强ACTN3回补后ACTN3-KO肌肉中肌萎缩相关基因表达
为证实ACTN3基因在骨骼肌对地塞米松反应改变中的作用，实验通过RT-PCR检测了ACTN3基因回补后地塞米松诱导的ACTN3 KO肌肉中Mstn、Tmem100、Fbxo32和Trim63等肌萎缩相关基因的表达变化。其中ACTN3基因回补由重组腺相关病毒(rAAV-CMV-ACTN3)驱动，将AAV注射到ACTN3 KO小鼠的一条腿的胫骨前肌(TA)中，同时将空的对照载体注射到对侧腿的TA中。历时4周后ACTN3稳定表达，进一步用地塞米松(20mg/kg)处理小鼠，24小时后取材TA肌肉(图4A)。结果表明，在注射地塞米松24小时后，过表达ACTN3的肌肉显著增加了肌萎缩相关基因Mstn和Tmem100的表达(图4，b和c)，同样，在ACTN3 KO小鼠肌肉中进行ACTN3回补后，Fbxo32和Trim63的表达也上调(图4，d和e)，而蛋白质合成标记基因p-4ebp1和p-Akt显著下调(图S7)。综上表明，在ACTN3 KO小鼠肌肉中进行ACTN3回补后，再注射地塞米松肌萎缩相关的基因会重新高表达，蛋白质合成相关基因会重新下调。所以，缓解地塞米松诱导的肌萎缩的的确是ACTN3的缺失带来的效应。
图4.急性地塞米松处理增加ACTN3回补后ACTN3KO小鼠肌肉中肌肉萎缩相关基因的表达
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5、ACTN3的缺失可减缓雌性小鼠免受地塞米松诱导的肌肉萎缩
考虑到糖皮质激素可能存在性别差异作用，作者对成年雄性和雌性小鼠均进行了地塞米松诱导的肌萎缩造模再进行雌雄分别的检测。结果表明，在雄性小鼠中，WT和ACTN3 KO小鼠在股四头肌中对地塞米松表现出类似的萎缩反应；相对于生理盐水处理的对照小鼠，WT-Dex小鼠显示出11.1%的肌萎缩，而KO-Dex小鼠显示出14.1%的肌萎缩(图5A)。相比之下，作者在雌性小鼠中观察到肌肉萎缩有不同基因型的差异反应：雌性WT-Dex小鼠相对于WT-Sal小鼠显示出显著的肌肉萎缩(18.6%，P=0.0079)，而雌性KO-Dex相对于KO-Sal仅显示出较小的股四头肌质量损失(5.8%，P=0.1775)。双因素方差分析（two-way ANOVA）证实雌性股四头肌质量对地塞米松的反应存在显著的基因型效应(P=0.0045)。
雌性小鼠的TA最大肌肉力量检测结果显示，相对于WT-Sal小鼠而言，WT-Dex小鼠的TA最大力量显著降低(20.5%，P=0.0159)，而KO-Dex仅表现出最大力的小幅度降低(7.1%，P=0.4286)(图5B)。雌性小鼠股四头肌的纤维大小显示，地塞米松诱导的肌萎缩在WT小鼠和ACTN3 KO小鼠肌肉中均表现出2B快肌纤维面积的降低，且这种面积的降低与股四头肌质量的损失成正相关(图5C)。在另一方面，小鼠TA的总纤维数并没有变化(图S9)，但WT-Dex小鼠肌肉相对于WT-Sal小鼠(图5D)显示出2X纤维比例的小幅增加(1.65%，P=0.0079)。KO-Dex小鼠相较于KO-Sal小鼠在肌纤维数量上无显著变化。综上，均被Dex处理的ACTN3 KO雌鼠与WT雌鼠相比股四头肌Qu质量的保持更好，胫骨前肌TA最大肌肉力量的保持及肌纤维数量的保持更好，所以ACTN3的缺失可保护雌性小鼠减缓地塞米松诱导的肌肉萎缩。
作者进一步分析蛋白质合成信号标记物（4ebp1和S6RP)和标记肌生长抑制的蛋白(Smad3)的变化。研究表明，与WT-Sal小鼠相比，WT-Dex小鼠肌肉显示出磷酸化S6RP发生微少但显著的下降，这表明WT-Dex小鼠蛋白质合成信号下降。相比之下，KO-Dex小鼠肌肉在磷酸化S6RP上无显著趋势但是其标志蛋白质合成的4ebp1磷酸化发生显著增加，且肌生长抑制信号Smad3磷酸化呈下降趋势，这表明，KO-Dex小鼠的肌萎缩趋势被抑制了。
在地塞米松给药10天后，抑制肌肉生长的smad3信号会恢复到原来的基础水平，为此研究人员给一组雌性小鼠连续7天注射地塞米松，并记录萎缩信号在转录水平上的变化(图5F)。结果表明，与WT-Sal小鼠相比WT-Dex肌肉显示出蛋白降解与肌萎缩相关基因Fbxo32和Mstn表达显著增加，但Trim63没有显著变化。而与WT-Dex相比，KO-Dex小鼠肌肉显示出这些基因的激活减少。且与KO-Sal相比，KO-Dex小鼠肌肉Trim63有减少的趋势。地塞米松诱导的Mstn存在响应ACTN3基因型的显著差异(P=0.004)，即ACTN3 KO小鼠相较于WT小鼠Mstn的表达更低，这与上述ACTN3缺失小鼠可抵抗地塞米松诱导的肌肉萎缩是一致的。所以，ACTN3 KO小鼠对地塞米松诱导的肌萎缩的抵抗作用确实存在性别差异，在雌鼠中这种维持肌肉蛋白质合成拮抗蛋白质降解的抵抗作用优于雄鼠。
总结
图6.α-Actin-3缺乏对肌肉质量调节的影响和对地塞米松诱导的肌肉萎缩的适应性反应
综上所述，本研究表明ACTN3通过调节肌肉蛋白合成和分解信号通路参与肌肉质量调控。ACTN3 KO小鼠显示出与在人中ACTN577X缺失纯合多态性类似的表型：对糖皮质激素诱导的抗炎和肌肉萎缩信号应答的抑制作用。在女性中，ACTN3缺乏症(全世界5人中有1人)可缓解地塞米松引起的肌肉萎缩，这也提示性激素信号也影响ACTN3基因型对长期处理糖皮质激素的反应。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34215586/
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