代谢学人

Cell Metabolism ：GDF15点燃生酮饮食的减重奇迹

撰文 | 夏志蕊 王颖雯 闪光余 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

肥胖的流行增加了代谢性疾病、心血管疾病甚至癌症的健康负担，影响了全球9多亿人。因此，它不仅对人类健康产生了巨大的威胁，也对公共卫生系统造成了沉重的负担。由于对体育活动干预的结果不理想和减肥药物的安全性问题，饮食调整已被提出作为一种有效的减肥策略。在过去的几十年里，大量的研究人员致力于探索控制肥胖的饮食方案，如调整不同碳水化合物、蛋白质和脂肪的常量营养素组成，以及热量限制的间歇性禁食。然而，对于肥胖管理来说并不存在“一刀切”的饮食，因此为个人量身定制饮食建议并优化个体的遵循程度是很重要的。生酮饮食(ketogenic-diet，KD)是一种高脂肪、适量蛋白质和极低碳水化合物(或无碳水化合物)的饮食（小编注：在经典的生酮饮食结构中脂肪占比约85%，蛋白质10%，碳水化合物5%，在这样的饮食结构下，由于碳水化合物摄入限制，身体的主要能源代谢从利用葡萄糖转变为利用脂肪，由于脂肪的不完全燃烧，产生酮体这类中间产物），已成为肥胖管理饮食的另一替代选择。

生酮饮食的应用

生酮饮食（KD）疗法最开始用于治疗癫痫及神经系统相关疾病，后续也用于治疗癌症、糖尿病等相关疾病，是在患病状态下采用的一种不同于药物治疗从而缓解症状的治疗手段，在临床治疗方面得到了应用。但是因为生酮饮食能快速诱导体重的减轻，这种效果是由于体内水分损失、饮食本身的特殊作用，还是由于饱腹感的增加使得总能量摄入的减少造成的，目前都是并不完全清楚的，并且比较低脂肪和低碳水化合物饮食的对照研究并没有证明这两种饮食方式在减肥方面的优越性。机体在进入酮症状态后，通常不会出现代谢并发症或疾病，但在例如压力和长时间禁食的情况下，包括酮症酸中毒在内的危险副作用可能会发生。除此之外，酮饮食的其他潜在相关作用是改善血糖控制，降低甘油三酯和LDL颗粒的浓度，然而在使用生酮饮食的患者中，含有脂蛋白的apoB总数显著增加。apoB水平的升高会增加心血管疾病的患病风险，没有糖尿病和代谢综合征的受试者应该仔细考虑这种饮食方式是否适合长期实施。

目前，KD已被成功确立为治疗难治性癫痫的一种饮食方法，并在过去十年研究中迅速引起了关注。这种饮食可增加循环酮体（小编注：循环酮体是指脂肪酸β-氧化产物乙酰CoA在肝脏和肾脏中可生成乙酰乙酸、β-羟基丁酸和丙酮。酮体被肝外组织吸收后，有两条代谢途径，一条是进入线粒体氧化分解，这是其主要代谢方式；另一条是在细胞质中参加脂合成。其中乙酰乙酸发生还原反应生成β-羟基丁酸，发生脱羧反应生成丙酮；β-羟基丁酸可由D-β-羟丁酸脱氢酶重新氧化生成乙酰乙酸，然后生成乙酰乙酰辅酶A，乙酰乙酰辅酶A在硫酶的作用下生成乙酰辅酶A，再通过β-氧化和三羧酸循环提供能量。丙酮可先被单加氧酶催化羟化，然后可生成丙酮酸或乳酸、甲酸、乙酸等，参与体内代谢循环。需注意的是，通常情况下，健康人的血酮体值在0.1~0.25 mmol/L。当体内糖代谢紊乱加重、胰岛素分泌不足时，脂肪分解加速，酮体生成超过身体所需，导致酮体在血液内堆积，以致血中酮体增加，当血酮值≥0.5 mmol/L时则称为酮症。而糖尿病患者因有机酸积聚而发生代谢性酸中毒时称为糖尿病酮症酸中毒，严重时可引起昏迷,导致死亡）——即一种葡萄糖的替代能源，而这种“代谢酮症”的状态类似于禁食状态（小编注：在正常状态下，机体动用身体储存的糖原来维持生命活动，而在禁食状态下，人体通过“糖质新生”（ 糖质新生是指把蛋白质，脂肪转化为葡萄糖）产生能量，肝脏将脂肪和氨基酸作为能量来源，同时肝脏中产生大量的脂肪代谢中间产物即酮体），因此KD可算作是折中的禁食。在小鼠实验中，KD已被证明可以降低血糖，提高胰岛素敏感性，甚至可以延长寿命和“健康寿命”（小编注：健康寿命（health span）指的是机体不发生重大疾病，并且机体的记忆力、力量、耐力、反应力和协调性等机体功能指标都保持在正常水平的生命时间）。自20世纪70年代以来，KD已被用于减少癫痫患者的癫痫发作。目前，KD在多囊卵巢综合征、多囊肾疾病、慢性疼痛、神经退行性疾病、流感病毒感染、肿瘤生长和癌症中的作用，以及它是否能作为普通个人或训练有素的运动员的营养方法尚未被揭示。鉴于其带来的多种功能以及对肥胖管理的有益作用，KD已经引起了科学家的大量关注，但其潜在的机制尚不清楚。

生长分化因子15 (GDF15)（小编注：它作为一个炎症的标记物在肿瘤发病、缺血性疾病、代谢疾病以及神经元退行性疾病中扮演着重要作用。GDF15正常情况下并不在成人心肌表达，不过在心肌损伤后心脏内的心肌细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞都会显著表达GDF15。GDF15也是抑癌基因p53诱导表达的主要分泌蛋白之一，来抑制肿瘤的生长。肿瘤中的细胞环境也能通过增加GDF15的分泌来促进肿瘤血管生成。）是转化生长因子β(TGF-β）超家族的独特成员，在20世纪90年代末被首次发现。据报道，在广泛的细胞应激(例如肥胖、心肾衰竭、慢性肝病和各种癌症)和线粒体疾病中，GDF15的循环水平显著升高，在这些疾病中，GDF15被认为是一种有效的生物标志物。GDF15的表达可以在多种组织(如肝、肾、肠和胎盘)中被诱导，以响应各种不同的刺激（小编注：组织损伤、氨基酸剥夺、缺氧、内质网应激、线粒体功能障碍、线粒体应激和UPR等应激信号会诱导GDF15的表达分泌，并与受体GFRAL结合。GFRAL在结合GDF15后与辅助受体RET结合形成GDF15-GFRAL-RET complex复合物，激活下游AKT, ERK and PLC-ϒ信号通路。在流行病学研究中，GDF15水平升高通常预示着不良结果，许多研究者认为升高的GDF15促成了这些不良结果。但流行病学研究的是相关性，并不能预测因果关系。而这一观点也与许多动物模型相矛盾，如：重组GDF15处理ob/ob小鼠能减少体重并改善胰岛素敏感性，而用GDF15抗体处理又能增加高脂饮食小鼠的脂肪重量和肝脏脂肪沉积并损害糖耐量，即GDF15过表达改善了病症而该基因下调或缺失使疾病恶化，因此，GDF15在病理生理学中的作用及其确切生物学作用仍有待阐明）。在致肥胖条件下通过转基因过表达GDF15或重组GDF15给药可改善代谢参数，促使其成为预防和治疗肥胖的新靶点，而GDF15的同源受体GFRAL于2017年底被发现。这些突破性的研究进一步推动探索了GDF15在肥胖调控及其治疗中的应用。GDF15的一个特征是抑制食物摄入，一些报道和研究人员团队的初步工作证明，KD喂养的动物食物摄入量减少，表明GDF15与KD的肥胖管理之间存在潜在联系。

近期发表在Cell Metabolism上的一篇名为“GDF15 is a major determinant of ketogenic diet-induced weight loss”的文章研究了GDF15在KD介导的体重减轻和相关的有益代谢中的作用。KD喂养诱导循环GDF15轻微升高，从而抑制能量摄入，减少体脂量。研究人员通过使用Gdf15-/-或Gfral-/-小鼠，发现了GDF15-GFRAL信号轴对KD的减重作用至关重要，同时也证实了KD诱导的GDF15来源于肝脏PPARγ的激活。在肝脏Pparγ敲除小鼠中，KD对肥胖管理的有益作用大大减弱，而给予AAV-Gdf15或重组GDF15可以使这种作用显著恢复。总之，这项研究结果揭示了KD对肥胖管理的作用。

敲黑板啦！

1.KD降低体重，增加循环GDF15的水平。

2.KD抗肥胖效应与GDF15介导的能量摄入抑制有关。

3.KD抗肥胖效应与FGF21介导的能量消耗有关。

4.肝脏PPARγ直接调控Gdf15的转录和表达。

研究结果

1.在小鼠、猪和人类中，KD喂养可降低体重，同时升高循环的GDF15水平

为了了解KD介导的体重变化情况，研究人员首先给肥胖小鼠喂食KD或对照高脂饮食(HFD) 15天(图1A)，发现从第6天开始KD组体重逐渐下降，而HFD组体重增加。15天的KD喂养使小鼠体重从39.10±0.33 g降至35.94±0.61 g(图1B、C)，并且从第3天开始，KD小鼠的累计能量摄入(kcal)减少了16.48%的同时循环GDF15增加了2倍(图1D、E)。为了进一步确定KD是否特异性诱导GDF15的表达，研究人员给予小鼠几种广泛使用的肥胖管理饮食(包括地中海饮食、低脂饮食、高蛋白饮食和低血糖指数饮食)（小编注：地中海饮食的特点是食用不饱和脂肪和富含亚硝酸盐和硝酸盐的蔬菜，使得硝基脂肪酸能够内源性形成；低脂饮食结构中使得10%的能量来自脂肪，20%来自蛋白质，70%来自碳水化合物；高蛋白饮食结构中60%的能量来源于蛋白质；低血糖指数饮食宏量营养素能量百分比为65%的碳水化合物，21%的蛋白质和14%的脂肪，但是其中的淀粉由70%直链淀粉/30%支链淀粉组成）(辅图1A、B)，同时又设计了两种禁食方案:每隔一天禁食和限时喂养（小编注：在限时喂养（tRF）下，小鼠被允许在ZT13（关灯后1小时）和ZT21（开灯前3小时）之间获取食物。每天12小时亮灯，12小时关灯，每天通过在有食物和水的笼子和仅有水的笼子之间转移小鼠来调节食物获取。）(辅图1C-F)，并测量它们的血浆中循环的GDF15水平。结果表明，这些类型的饮食在测试的时间内并不能提高小鼠血浆中循环GDF15的水平。为了进一步探寻KD和GDF15之间的联系，研究人员选择了一种广泛使用的临床前模型——猪，来进行KD干预试验(图1F)。研究结果显示，在给予处理15天后，KD处理组的猪体重下降，GDF15循环水平增加了约1.5倍(图1G、H、I)。最后，研究人员招募了一组肥胖患者进行为期2周的KD干预(图1J、K)。在干预结束时，患者的体重从91.44±1.04 kg降至86.47±0.75 kg，GDF15循环水平升高了约1.9倍(图1L)。以上结果表明KD喂养降低了体重，增加了循环GDF15的水平。

生酮饮食的应用生酮饮食减肥机制

人体的三大能量来源主要是碳水化合物、脂肪和蛋白质，正常情况下葡萄糖是机体主要的能源物质。在低碳饮食下，由于血糖供应不足，机体会启动肝糖原分解产生葡萄糖，肝糖原耗尽后机体将从葡萄糖供能模式转变为脂肪分解供能模式。

生酮饮食属于一种极低碳水化合物饮食，其脂肪占比约85%，蛋白质10%，碳水化合物5%。生酮饮食与其他低碳水化合物饮食的不同之处在于，生酮饮食对于蛋白质的摄入也有限制。在这种饮食结构下，胰岛素分泌减少，导致糖原分解、糖异生和脂肪分解增加。待到血液中的葡萄糖中消耗殆尽时，糖异生不能再为作为替代途径产生葡萄糖，于是机体就会从利用葡萄糖供能的状态转变为利用脂肪酸供能的状态。脂肪分解增加的过程中导致酮体的产生，即β羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮三种物质的统称。然而，过多的蛋白质摄入也会促进氨基酸转化为葡萄糖，从而阻止酮体的产生，所以生酮饮食也会限制蛋白质的摄入。

首先，生酮饮食由于高脂肪的摄入，往往能够增加饱腹感，并且游离脂肪酸的升高以及酮体的产生也可通过抑制食欲从而一定程度上减少能量的摄入。低碳水化合物的摄入减少，导致体内胰岛素分泌下降，减弱了胰岛素的促脂肪合成作用，从而增加了机体的脂肪分解。其次，在酮体生成以及糖原的分解过程中均会减少体内的水分，所以在生酮饮食的早期会出现明显的体重下降。由于机体的绝大多数器官依赖葡萄糖供能，在长期的低碳饮食下，机体启动糖异生模式可能会促进肌肉蛋白质的分解而造成肌肉消耗，因此也会引起体重的下降。

[1].Basolo A, et al. Nutrients. 2022;14(9):1814 

[2].McGaugh E, et al. Mo Med. 2022;119(1):84-88.

图1 KD喂养降低体重，同时增加循环的GDF15水平

辅图1 不同类型的饮食和饮食方案对血浆中GDF15水平的影响

2.GDF15-GFRAL信号轴对于KD引起的体重减轻是必需的

接下来，研究人员试图探究GDF15在KD肥胖管理中的作用。为此，研究人员使用了Gdf15缺陷(Gdf15−/−)小鼠并给予KD 30天。与上述的15天短期喂养一致，30天的KD处理显著增加了野生型(WT)小鼠的循环GDF15水平（约2.26倍），但在Gdf15−/−小鼠中却没有发现GDF15水平的升高(图2A)。同时KD喂养降低了WT小鼠的累计能量摄入量和体重(图2B、C)，但对Gdf15−/−小鼠没有影响。相反，KD喂养使Gdf15−/−小鼠的体重从32.19±0.93 g增加到35.29±0.79 g，相当于与初始体重对比增加9.64%±1.98%，且KD喂养的Gdf15−/−小鼠的体重几乎与HFD对照组一致(图2C)（小编注：根据营养成分表，HFD和KD饲料配比中蛋白质能量均为10%，此外，HFD包含、15%碳水化合物、75%脂肪；KD包含90%脂肪，从成分来看，使用HFD作为KD的对照饮食相对合适）。同样，KD喂养降低了WT小鼠的脂肪质量和肝脏重量，但Gdf15-/-组没有发现类似的结果(图2D、E)。同时，KD喂养降低了WT小鼠血浆中甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，以及肝脏中TG含量(图2F、G、H)，并且改善了胰岛素敏感性(图2I、J)以及葡萄糖耐量(图2K-L)，而在Gdf15-/-小鼠中这些改善作用并没有显示出来。总之，这些结果表明GDF15对于KD介导的肥胖管理是不可或缺的。

随后，研究人员通过使用GDF15中和抗体（小编注：当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体，中和抗体能够与病毒表面的抗原结合，并直接阻断病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞。但是有时也将能够与特定蛋白质结合，并阻断其功能的抗体称为中和抗体。）进一步测试循环GDF15的升高是否有助于KD的减肥效果。该抗体在两组WT小鼠中验证了其有效性，这些小鼠其中一组单独接受外源性GDF15，另一组同时接受外源性GDF15及其中和抗体(辅图2A、B)。与相应的HFD对照组相比，IgG处理的KD小鼠体重减轻，而GDF15的中和抗体处理后，KD喂养小鼠的体重开始缓慢上升，达到初始体重的4.32%±1.83%(辅图2C、D)，这表明GDF15直接介导了KD引起的减重效应。

随后，研究人员在Gfral-/-小鼠中也测试了GDF15在KD介导的体重控制中的作用。不管是否敲除Gfral都会导致循环GDF15都升高，但在没有GFRAL的情况下，KD小鼠的累计能量摄入、体重、脂肪质量和肝脏重量都没有明显降低(图3A-E)。此外，在Gfral-/-小鼠中，KD对肝脏TG、血浆ALT和AST、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的改善作用也未体现(图3F-K)。总之，这些结果表明GDF15-GFRAL信号轴在小鼠KD的有益代谢作用中起重要作用。

图2 GDF15对于KD的减重效应是必需的

图3 GFRAL对于KD的减重效应是必需的

辅图2 Anti-GDF15抗体在小鼠中的中和作用

3.KD的抗肥胖效应是通过调节GDF15介导的能量摄入抑制和FGF21介导的能量消耗来实现的

为了测试能量摄入的减少或能量消耗的改变是否有助于实现KD小鼠的体重控制效果，研究人员首先对小鼠按能量进行了配对喂养（小编注：配对饮食就是使得不同实验组别的动物日平均能量摄入量相同；在本研究中将小鼠分为三组：( 1 ) HFD自由喂养，( 2 ) KD自由喂养，( 3 ) HFD限制饲养以匹配相应KD喂养组前一天所消耗的热量。小鼠分别喂养HFD或KD 9天，并且每日测量体重和能量摄入量。），目的是探究这种处理是否可以消除KD小鼠与HFD对照组之间的体重差异(辅图3A)。结果表明配对喂养在很大程度上消除了KD和HFD小鼠之间的体重差异(辅图3B)，这表明（1）抑制能量摄入在这一过程中起主要作用，（2）能量消耗存在潜在的作用。然后，研究人员对自由饲喂KD和HFD的Gdf15-/-和WT小鼠使用了间接测热法（小编注：间接测热法是指通过测定氧气消耗量和二氧化碳生成量和尿氮排出量计算出机体所生成的热能的方法。），以确定能量消耗是否存在着额外的影响。通过协方差分析(ANCOVA)，以瘦体重为协变量得到的结果显示，KD喂养的小鼠无论GDF15是否存在，其能量消耗都高于HFD对照组(辅图3C、D)。以上数据和KD条件下GDF15依赖性的能量摄入抑制结果(图2B、C)都表明KD介导的肥胖管理既包括GDF15调节的能量摄入，也包括独立于GDF15的能量消耗。

有研究表明，KD喂养可增加小鼠中循环FGF21水平，这是一种已知的可增加能量消耗的激素。因此，研究人员测量了循环中的FGF21，发现KD喂养的WT和Gdf15-/-小鼠的FGF21水平升高，其肝脏中的Fgf21 mRNA水平也升高(辅图4A、B)。为了探索KD喂养下独立于GDF15的能量消耗增加的原因是否是FGF21，研究人员用FGF21中和抗体处理KD喂养的Gdf15-/-小鼠和WT对照组(辅图4C)，结果显示HFD和KD喂养的小鼠之间能量消耗不存在差异(辅图4D、E)，证实了FGF21是KD喂养下能量消耗增加的原因。值得注意的是，图2C所示的HFD喂养的Gdf15-/-小鼠和KD喂养的Gdf15-/-小鼠之间的体重差异，在后续使用FGF21中和抗体处理后则消失(辅图4F)。总的来说，这些数据表明KD的抗肥胖作用是通过协调GDF15介导的能量摄入抑制和FGF21介导的能量消耗来实现的。

FGF21

FGF家族成员具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，并参与多种生物过程，包括胚胎发育，细胞生长，形态发生，组织修复，肿瘤生长和侵袭。FGF19亚家族由FGF15/19、FGF21和FGF23组成，包含内分泌因子，都能够分泌到机体的各个器官发挥作用。

成纤维细胞生长因子21（FGF21）属于FGF19亚家族成员，由209个氨基酸组成，属于内分泌型胞外蛋白，1-28区段为信号肽引导分泌，主功能域为29-216区段，其中C端包括一段无序结构，较易被FAP水解失活，主要在肝脏表达，作用于脂肪、肝脏和胰腺组织，调控糖脂平衡等物质代谢，是一种代谢激素。在包括肝脏在内的许多组织中，FGF21水平较低，但是被营养和细胞应激信号显著诱导。FGF21能够在禁食、饥饿条件下，被转录因子PPARα诱导转录，并参与调节适应性禁食反应；并且FGF21能在高糖/低蛋白组合条件的营养状态下被最大程度诱导。但是以上FGF21在人体内的诱导具有保守性，人体循环中FGF21的水平受到饥饿、高糖摄入量和膳食蛋白质限制的调控，相比之下，生酮饮食不会诱导人类血浆中FGF21水平。

一旦FGF21分泌，能够与共受体KLB和传统FGF受体成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）组成的受体复合物结合并激活，当KLB缺失时FGF21不能直接与FGFR结合，说明KLB是FGF21的靶向受体，能够促进与FGFR1c的结合，FGFR1c作为效应受体发挥作用。

FGF21在调节体重、肝脏甘油三酯和常量营养素偏好方面的代谢作用是保守的。FGF21具有强大的胰岛素增敏作用，FGF21通过直接作用于脂肪组织，急性增强胰岛素敏感性；长期FGF21发挥重要的能量稳态调节作用，FGF21能够介导中枢神经系统发挥减轻体重的作用；FGF21能够介导脂肪和肝脏代谢降低甘油三脂，从而逆转脂肪肝的发展。

[1]. Flippo KH, et al. Nat Metab. 2021;3(3):309-317.

辅图3 KD在体重改变和能量消耗方面的作用

辅图4 GDF15和FGF21协同介导了KD诱导的减重效应

4.KD诱导的GDF15来源于肝脏

为了探究KD诱导的GDF15主要来自哪个器官，研究人员检测了包括肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌、回肠和结肠在内的组织中Gdf15基因的表达。与HFD对照组相比，KD喂养小鼠肝脏中Gdf15 mRNA的表达明显增加(图4A)。值得注意的是，KD喂养的猪肝脏中Gdf15的表达也显著增加(辅图5A)。通过进一步的荧光原位杂交显示，Gdf15在小鼠肝细胞中表达明显(图4B、辅图5B)，表明KD诱导的GDF15升高主要来自肝脏。

为了研究KD是否能在体内诱导肝脏GDF15的产生，研究人员用AAV8病毒敲低小鼠肝脏的Gdf15(图4C)，发现KD喂养不能显著增加AAV-Gdf15（过表达Gdf15敲减的腺相关病毒）小鼠的血浆GDF15(图4D、E)，表明KD诱导了肝脏GDF15的产生。接下来，研究人员探究了肝脏Gdf15对KD肥胖管理效果的影响，发现肝脏Gdf15下调后，KD喂养对能量摄入的抑制作用和体重减轻效果明显降低(图4F、G)。并且在AAV-Gdf15i小鼠中，KD对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的有益作用消失，同时KD喂养小鼠和HFD对照组也显示出相当水平的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性(图4H-K)。在接受AAV-Gdf15i病毒的小鼠中，KD的减脂作用明显减弱(图4L)。因此肝脏是KD诱导GDF15产生的主要部位。

图4 KD干预期间的循环GDF15主要来源于肝脏

辅图5 接受KD的小鼠和猪的附加数据

5.肝脏PPARγ直接调控Gdf15的转录

为了研究KD诱导的肝脏GDF15的转录调控，研究人员对HFD和KD喂养小鼠的肝脏进行了RNA-seq分析(图5A)。KEGG通路分析显示，差异表达基因（DEGs）在多种通路中富集，尤其是PPAR信号通路(图5B)，其中包括PPAR及其靶基因在内的15个基因在KD饲喂后显著上调(图5C)，并且qPCR的结果分析也验证了以上结果(辅图5C)。PPAR是一个核受体亚家族，有三个成员:PPARa、PPARγ和PPARβ/δ。值得注意的是，在喂食KD的小鼠肝脏中，只有Pparγ mRNA的表达明显增加(图5D)，而Pparα和Pparβ/δ的表达没有明显变化(辅图5D、E)。此外，研究人员还发现KD喂养的猪肝脏中Pparγ mRNA也显著增加(辅图5F)，而饲喂KD的小鼠肝脏中PPARγ蛋白水平也升高(图5E)。总之，这些结果表明PPARγ和GDF15之间可能存在相关性。

为了研究转录因子PPARγ是否直接调控Gdf15的转录，研究人员分析了约2 kb的Gdf15启动子序列，并鉴定了四个可能的PPAR响应元件(图5F)。荧光素酶报告基因检测实验的结果显示在小鼠正常肝细胞AML12中PPARγ的表达显著激活了Gdf15启动子(图5G、H)。研究人员还通过ChIP-qPCR分析发现，PPARγ与Gdf15启动子区域的保守转录结合位点结合(图5I)。此外，研究人员还构建了两个由WT Gdf15启动子和转录结合位点突变Gdf15启动子驱动的荧光素酶报告基因(图5J)，结果表明PPARγ过表达显著增强了WT Gdf15启动子报告基因活性，但对突变型没有影响(图5K)。最后，研究人员通过ChIP实验进一步检测PPARγ与Gdf15启动子的体内结合情况，结果表明，在KD喂养小鼠的肝脏中，PPARγ与Gdf15启动子的结合明显增强(辅图6A-F)。以上结果表明PPARγ作为转录因子促进Gdf15的转录和表达。

为了进一步确定肝细胞是否能够响应PPARγ并增加GDF15的水平，研究人员用PPARγ的激动剂罗格列酮培养小鼠正常肝细胞AML12，发现该细胞系经过处理后诱导GDF15释放到培养基中，并且细胞中Gdf15 mRNA的表达升高(图5L、M)。然后研究人员在AML12细胞中过表达Pparγ，发现释放到培养基中的GDF15水平上升，Gdf15 mRNA表达增加(图5N、O)。同样，在人原代肝细胞中，罗格列酮治疗或Pparγ过表达均显著增加GDF15向培养基中的释放和Gdf15 mRNA的表达(辅图7A-D)。鉴于PPARγ在脂肪细胞中高度表达，研究人员进一步研究了脂肪PPARγ是否以与肝脏PPARγ相似的方式发挥作用。与肝细胞的结果相反，在罗格列酮或过表达Pparγ处理的分化的3T3-L1细胞中几乎检测不到培养基中的GDF15(辅图7E、F)，进而排除了脂肪细胞中GDF15转录和产生的类似调节机制。此外，众多研究表明肝脏整合应激反应(ISR)（小编注：整合应激反应（integrated stress response ISR）是蛋白质稳态失调时诱发的信号中心调控网络，可以对发生在内质网和细胞浆中的应激作出反应，ISR能够整合细胞内的各种应激状态，包括蛋白质稳态失调、营养缺乏、病毒感染和氧化还原失衡。未折叠蛋白反应（unfolded protein response UPR）可以识别内质网中错误折叠的蛋白，热休克反应（heat shock response HSR）则负责细胞浆部分，从而促进蛋白正确折叠和降解。ISR可以通过调节eIF2α的磷酸化水平与UPR和HSR耦连，调控基因表达，ISR系统可以使细胞整体上减少翻译起始率，并增加特定mRNA的翻译，二者对细胞基因表达重编程，维持细胞功能平衡：提高蛋白质折叠能力，支持细胞分化，响应细胞损伤。当ISR启动后仍然无法缓解细胞应激状态，ISR会诱发细胞凋亡，清除受损细胞。）上调GDF15的表达。因此，研究人员通过检测ISR的关键转录调控因子ATF4和CHOP的肝脏蛋白水平来研究KD诱导的GDF15表达是否与ISR激活有关，在喂食KD的小鼠中检测到的两种蛋白的水平和HFD对照中检测到的蛋白水平相似(辅图5、H)，进而排除了ISR在肝脏GDF15产生中的潜在参与。总之，这些结果表明Pparγ以肝细胞特异性的方式上调Gdf15的表达。

PPAR

PPAR是一种过氧化物酶体增殖物激活受体，该受体属于核受体（NR）超家族，已确定的包括三种亚型，分别为PPARα（NR1C1）、PPARδ/β（NR1C2）、PPARγ（NR1C3）。它们是配体激活后调节基因表达的转录因子，可以调节编码控制代谢稳态和多器官功能的蛋白质基因，包括肝脏、脂肪组织、肠、骨骼肌、血管壁和心脏。

所有PPAR都具有大多数核受体的基本结构，由A/B、C、D和E/F四个功能域组成。N-末端A/B结构域包含非配体依赖性激活功能（AF-1）。DNA结合域（C结构域）是一个保守的结构域，由两个锌指结构组成，负责PPAR与靶基因启动子中的过氧化物酶体增殖反应元件（PPRE）结合。D结构域是各种辅助因子的结合位点。E/F结构域（配体结合结构域）结合多种内源性或外源性亲脂性配体，并提供配体特异性。参与转录过程的PPAR辅因子的募集由位于E/F结构域的配体依赖性激活功能（AF-2）介导。

其中PPARα和PPARδ在氧化组织中高度表达，并调节与底物传递、底物氧化和氧化磷酸化的相关基因。PPARα主要在肝脏、心脏、骨骼肌、棕色脂肪组织(BAT)、肠道和肾脏中表达，促进能量消耗,也影响脂肪酸的转运、酯化和氧化来调节其功能。PPARβ/δ在各种器官中普遍表达，参与脂肪酸氧化，调节血糖水平。PPARγ也在肝脏、骨骼肌、肠道和免疫细胞中表达，但PPARγ主要促进脂肪生成和脂质合成来进行能量储存，其在白色脂肪组织（WAT）中表达量最高。

[1]. Christofides A ,et al. Metabolism. 2021;114:154338.

图5 肝脏而非脂肪组织中的Pparγ上调Gdf15的表达

辅图6 肝脏PPARγ调控Gdf15的表达

辅图7 PPARγ激动剂和Pparγ过表达在GDF15表达中的作用以及在人原代肝细胞和鼠源分化的3T3-L1细胞中的产生

6.肝脏Pparγ敲除小鼠血浆GDF15水平降低，且KD带来的肥胖管理效果消失

为了更好地了解肝脏PPARγ和GDF15在体内产生之间的关系，研究人员首先使用AAV8病毒构建了肝脏Pparγ敲低小鼠(图6A)。与scramble shRNA相比，接受AAV8-Pparγ shRNA的小鼠，KD诱导的肝脏Gdf15 mRNA的表达和分泌明显减少(图6B、C)。在肝脏Pparγ基因敲低后，KD的减肥效果也明显减弱(图6D)。研究人员进一步测试了KD对肝脏特异性Pparγ基因敲除(Pparγ△Hep)小鼠的肥胖管理作用(图6E)，发现KD诱导WT小鼠分泌GDF15，但在Pparγ△Hep小鼠中没有发现类似的效果(图6F)。与KD喂养的WT小鼠体重减轻相反，Pparγ△Hep小鼠的体重增加(图6G)，也就是说在Pparγ△Hep小鼠中，KD喂养对能量摄入的抑制作用和脂肪量的减少效应消失(图6H、I)。KD喂养显著降低了WT小鼠血浆TG水平、肝脏脂质含量和肝脏重量，而在Pparγ△Hep小鼠中基本没有这种作用(图6J-L)。此外，随着肝脏Pparγ基因缺失，KD对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的有益作用也随之消失(图6M、N)。综上所述，肝脏PPARγ是KD对肥胖控制的关键分子。

图6 肝脏Pparγ缺失小鼠血浆GDF15水平降低，且KD带来的肥胖管理效果消失

7.肝脏Gdf15过表达或重组GDF15给药可恢复Pparγ△Hep小鼠给予KD后的代谢益处缺失

为了探究KD在Pparγ△Hep小鼠体内的有益作用缺失是否是因为肝脏Gdf15表达和循环GDF15下降，研究人员恢复了Gdf15在肝脏中的表达来进行体内挽救实验(图7A)。与接受AAV空载的Pparγ△Hep小鼠相比，肝脏过表达Gdf15可显著诱导小鼠GDF15分泌(图7B)，并且恢复KD喂养对能量摄入、减重和减脂的效果(图7C-E)。同样，肝脏中GDF15的回补恢复了KD喂养的Pparγ△Hep小鼠受损的糖耐量，并降低了肝脏TG含量(图7F、G)。

研究人员随后进一步使用重组GDF15来测试循环GDF15的升高是否能够恢复KD在Pparγ△Hep小鼠中受损的有益效应(图7H、I)，结果发现重组GDF15有效地恢复了Pparγ△Hep小鼠能量摄入的抑制，体重、脂肪量和肝脏TG含量的降低(图7J-M)，并且恢复了Pparγ△Hep小鼠受损的糖耐量(图7N)。总的来说，这些结果表明肝脏PPARγ通过上调GDF15的产生来控制KD介导的代谢益处。

图7 肝脏Gdf15过表达或rGDF15可恢复KD在Pparγ△Hep小鼠中受损的减肥作用

总结

目前，KD已被推广为一种肥胖管理饮食，但其潜在机制尚不清楚。本研究表明，KD降低了人类、猪和小鼠的能量摄入和体重，并伴有GDF15的升高。在Gdf15-/-或其受体Gfral-/-的小鼠中，KD的减重效应消失，这表明GDF15-GFRAL信号轴在KD介导的体重减轻中发挥了重要作用。KD喂养后肝脏中Gdf15 mRNA水平升高，在肝细胞中使用AAV8敲低Gdf15则消除了KD对小鼠肥胖的控制作用，证实了GDF15的产生来源于肝脏。研究人员还发现发现KD激活肝脏PPARγ，并与GDF15启动子区域结合，直接促进Gdf15的转录和表达。肝脏Pparγ敲除小鼠的血浆GDF15水平降低，KD的肥胖管理作用显著减弱，但通过肝脏Gdf15过表达或重组GDF15给药可以恢复这种效果。总的来说，这项研究揭示了一种以前未被探索的GDF15依赖性机制，它是KD介导的肥胖管理作用的基础。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.adh5207https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S155041312300414X?via%3Dihub

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