代谢学人

Neuron: Irisin让你不再困在时间里

撰文| 胡敏 马莹 张俊 武霞 陈江榕 郭明伟 

编辑| 孟美瑶 

校对| 张俊

背景介绍

阿尔茨海默病（AD）是最常见的老年痴呆症，其特征是进行性失忆和严重认知障碍。淀粉样蛋白级联假说（Amyloid cascade hypothesis）认为：淀粉样蛋白-β（Aβ）是Aβ蛋白前体（APP）经过β-和γ-分泌酶连续切割后释放的，随后它在大脑中持续积累。Tau蛋白异常磷酸化假说认为：Tau蛋白是神经元中的一种可溶性微管结合蛋白，其主要功能是微管组装、物质运输和细胞形态维持等。在AD病理状况下，Tau蛋白发生异常翻译后修饰，如过度磷酸化，进而失去稳定微管结构的功能，造成神经元损伤。另一方面，过度磷酸化还会促进Tau蛋白聚集形成神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFTs），造成神经毒性。二者共同导致AD相关痴呆症。然而，仅针对Aβ或tau神经毒性的AD疗法并未展现出显著疗效，提示Aβ和tau之间存在相互作用，从根本上推动了疾病的发展。这一相互作用具体表现在：（1）聚集的Aβ通过增强GSK-3β和CDK-5的活性来诱导tau过度磷酸化，进一步驱动NFT的形成；（2）Aβ还可以激活caspase-3和钙蛋白酶 1，将Tau蛋白从C端裂解，截短的tau比全长tau更能快速组装成细丝；（3）Tau介导Aβ 毒性，由Aβ介导的过度磷酸化的tau通过作用于Drp1诱导线粒体的融合和裂变，从而诱导线粒体动力学功能障碍，最终导致ROS过量产生和细胞凋亡。因此Aβ类似于枪的“扳机”，而Tau蛋白类似于“子弹”，二者发挥协同作用，共同介导了AD患者的认知功能障碍。因此，预防AD的有效治疗方法可能是在早期就减少大脑中的Aβ负担。

在动物模型中，体育锻炼已被证明能改善AD病理学的各个方面，包括脑Aβ水平、淀粉样蛋白沉积和神经炎症，从而改善认知功能障碍。然而，运动减少Aβ水平的机制尚不清楚。先前已有研究表明，运动会增加AD小鼠大脑中降解Aβ的内肽酶——脑啡肽酶（NEP）的酶活性和水平，从而导致淀粉样蛋白减少。但是运动如何导致NEP活性/水平的增加仍是未解之谜。

Irisin是一种肌细胞因子，由其前体Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5（FNDC5）裂解而来，可调节脂肪组织中的葡萄糖和脂质代谢，并通过加速白色脂肪组织的棕色化来增加能量消耗。研究表明，FNDC5/Irisin（小编注：在许多关于Irisin的研究中，针对FNDC5抗体的WB显示有多条条带，一方面是Irisin本身的条带（和重组Irisin分子量一致），还存在着Irisin二聚体或糖基化，以及FNDC5本身（2022年发表在Eur Heart J上的文章表明FNDC5还可能通过外泌体分泌，作用到外周组织），因此无法分辨所检测的蛋白到底是FNDC5还是Irisin，故而用FNDC5/Irisin指代）存在于人类和小鼠的大脑中，尤其是海马区。最近有报道称，AD患者的海马和脑脊液（CSF）中以及AD小鼠模型大脑中的Irisin水平降低。此外，据报道，在AD患者的脑脊液中，Irisin水平与Aβ42含量（小编注：Aβ是含有39-43个氨基酸的多肽，它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，其中最常见的亚型为Aβ40和Aβ42。并且Aβ42更容易聚集，因此能够引发更强的神经毒性。Aβ蛋白除了沉积在中枢神经，还被发现在外周组织中沉积，包括脂肪组织、心脏、肌肉、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤和肠道，在表达水平上，人类星形胶质细胞产生的β-淀粉样蛋白水平高于任何其他细胞类型，提示胶质细胞是大脑中Aβ的主要来源。研究发现，在脂肪组织中，Aβ会通过PKA和ERK1/2依赖性信号通路诱导培养的人脂肪组织中的脂肪分解，并且减少脂联素分泌，同时增加瘦素和IL-6的分泌）以及小型精神状态检查（小编注：MMSE又称作简易精神状态检查，是一种用于评估老年人认知功能障碍等级的量表）评分呈正相关。此外，运动还能促进人体循环中的Irisin水平、野生型小鼠海马中的Fndc5基因表达以及AD转基因小鼠海马中的FNDC5蛋白表达。

前面提到AD的两个病理标志是细胞外淀粉样斑块和细胞内神经纤维缠结。于是学界推测二者存在一定关联。然而在2014年之前，尚未有研究在任何动物模型中证明这一点，于是本文通讯作者便在Nature上以第一作者身份开发了一种三维（3D）人类神经细胞AD培养模型（3D-AD模型）。该AD模型围绕着两项核心技术：人类神经祖细胞（hNPCs）可产生高浓度的致病性Aβ，以及基于Matrix的3D培养系统，该系统提供了一个有利于Aβ沉积的环境。首先，作者选择永生化的hNPC细胞系ReNcell VM（ReN）作为平台的基础，这些细胞可表现出显着的淀粉样蛋白病理学，多次传代中仍可存活，还容易分化为神经元和神经胶质细胞。作者利用装载有家族性 AD（FAD）基因的慢病毒感染ReN细胞（具体基因已在正文第一小节描述），使其在3D基质胶中分化并维持表达高水平FAD 基因，以促进Aβ。相比于2D培养系统，3D基质胶可阻止Aβ 扩散到培养基中，仅维持高浓度的Aβ。同时，他们选择的3D基质胶还包含了一个富含结构蛋白（如层粘连蛋白、胶原蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等）的大脑样微环境。总之，该模型表现出Aβ的大量生成，随后出现了p-Tau病理变化，首次在疾病模型上发现了Aβ通过GSK3诱导p-Tau病理的分子机制。

在本篇文章中，研究人员对Irisin是否会影响3D-AD 培养系统中的Aβ病理学展开了研究。他们发现，Irisin通过提高星形胶质细胞（astrocytes）分泌的可溶性NEP水平，进而降低Aβ的含量。他们还发现，Irisin诱导的NEP活性/水平增强是通过下调细胞外信号调节激酶（ERK）-转录激活因子 3（STAT3）信号通路介导的，其中ERK信号通路是胞外刺激信号传导至细胞内的中心调节因子，调控着细胞增殖、分化、迁移和血管生成相关等生理过程，而STAT3是星形胶质细胞增殖的关键调节因子。最后，研究人员发现星形胶质细胞上的整合素αV/β5受体是介导Irisin对NEP水平产生影响并进而降低Aβ水平的必要条件。

敲黑板啦！ 

1. Irisin促进NEP分泌，导致 3D-AD 模型中Aβ减少；

2. 整合素αV/β5是星形胶质细胞上的Irisin受体，可诱导 NEP 分泌；

3. Irisin通过下调 ERK-STAT3 信号介导 NEP 分泌。

研究结果

1 Irisin能缓解3D-AD模型中Aβ的病理变化

ReNcell VM 人源神经干细胞（ReN）表达与家族性 AD（FAD）相关的 APP_{Swedish/London}突变蛋白，称为 ReN-GA 细胞，同时该细胞系表达 APP_{Swedish/London}和突变的早老蛋白（presenilin-1）(PS1)_ΔE9则称为 ReN-mGAP 细胞，研究人员按照之前的方法将这两种细胞在三维培养系统中进行分化（图 1A 和 1B）。为了测试Irisin对Aβ病理学的影响，用 5ng/mL 和 500 ng/mL的重组Irisin蛋白处理分化了0.5或3.5周的 ReN-GA和 ReN-mGAP 细胞1.5 周（图 1B）。研究人员选择了5ng/mL和500ng/mL的Irisin含量是因为前者属于人体血浆中的正常生理水平，而后者已被证明在阻断骨细胞死亡方面具有最大效果。研究人员对2周或5周后的 3D-AD 培养物中的条件培养基和细胞进行分析后发现，培养 2 周和 5 周的 ReN-GA 和 ReN-mGAP 培养物条件培养基中的内源性Irisin水平没有差异（图 S1A）。与培养2周的 ReN-GA 相比，培养5周的 ReN-GA 的基质胶中Irisin减少了，而培养2周和5周的 ReN-mGAP 之间Irisin水平则没有变化（图 S1A）（小编注：研究人员将细胞培养在基质胶中，再添加用于细胞增殖的培养基和营养组分；当进行分化时，先将细胞重悬在基质胶中，然后再接种到孔板中，加入分化培养基进行分化。条件培养基指细胞上清组分，基质胶指细胞组分）。

5ng/mL和500ng/mL剂量的Irisin可以显著降低培养5周后ReN-GA条件培养基中Aβ40和Aβ42的水平，但是在基质胶中只有500ng/mL的Irisin抑制了Aβ水平（图1C）。相比于ReN-GA培养模型，ReN-mGAP 培养模型的AD病理更显著。在分化5周时，500 ng/mL的Irisin可降低条件培养基中的 Aβ40 和 Aβ42 水平，但在3D基质胶中，该剂量的Irisin仅降低了Aβ42 水平（图 1C）。与此同时，分化2周的Irisin的抑制效果较为轻微（图 S1B）。

乳酸脱氢酶（LDH）是细胞死亡/细胞毒性的指标（小编注：LDH是一种稳定存在于胞浆中的酶，在正常状态下，仅存在于细胞内，但是当细胞受到刺激死亡时，质膜发生破裂，LDH被迅速释放至细胞外，因此LDH释放是细胞毒性研究中使用较广泛的标记物），在为期5周的 3D-AD 培养模型中，Irisin没有增加LDH的释放（图 S1C），这表明5ng/mL和500ng/mL的Irisin不会导致细胞死亡，且Irisin降低Aβ含量并不是由于细胞死亡引起的。事实上，在5周3D-AD培养模型中，500 ng/mL剂量的Irisin还减少了LDH的释放，这表明Irisin具有神经保护作用。有研究表明，FNDC5的过表达会增加小鼠海马中脑源性神经营养因子（Bdnf）基因的表达，而BDNF可通过增强APP的α-分泌酶活性，促进分泌性APP（sAPPα）的生成，从而来减少Aβ的生成。结果显示，BDNF 水平大多低于可检测范围，同时Irisin也不会改变分化5周 3D-AD 模型培养基中的 BDNF 水平（图 S1D）（小编注：文献使用的是从小鼠大脑中提取的原代皮质神经元和海马神经元，是终末细胞，irisin诱导后会增加BDNF的水平。但是本文中用到的细胞是hNPCs，即人源神经祖细胞，是由人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（hiPCS）分化而来的，而hiPCS是利用各种方法从成纤维细胞等成体细胞类型中衍生而来的，其来源不一定是大脑，这是3D模型存在的较大局限性），这表明Irisin降低3D-AD细胞中Aβ的含量并非由BDNF介导。

使用G12A（APP-C末端）或6E10抗体进行的Western印迹分析表明，Irisin并没有显著改变5周3D-AD培养模型中全长APP（fl-APP）、APP-CTFα和APP-CTFβ的水平（小编注：背景介绍中提到APP是经过β-和γ-剪切酶连续切割后释放的，具体而言，APP的N端首先在β-剪切酶作用下，蛋白被分为APPSβ和C端的β-CTF，后者然后通过γ-剪切酶作用分为Aβ和AICD，这两个过程称为淀粉样蛋白剪切。如果APP在第一步是通过α-剪切酶作用则最终产生不具有毒性的非淀粉样蛋白）（图S2A和S2B），这表明Irisin并不影响APP的加工。

图 1| Irisin能减少Aβ、萎缩性神经元和过度兴奋性

图 S1| 3D-AD培养中Irisin、Aβ、LDH释放和BDNF的水平

2 Irisin能减少萎缩性神经突和过度兴奋性

从病理学角度看，萎缩性神经突起与Aβ和tau病变都有关联（小编注：神经突：神经突起是由神经元的细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突，用于细胞间的信息传输）。虽然Irisin没有改变淀粉样蛋白斑块的水平（利用3D6抗体检测），这可能是由于培养5周的3D-AD模型中斑块的水平较低（图 S2C），但Irisin处理显著减少了培养5周ReN-GA和ReN-mGAP模型中萎缩神经突的面积以及ReN-mGAP模型中萎缩神经突的数量（图1D和1E）。

在AD小鼠、体外模型和人体中，Aβ已被证明与神经元的过度活跃有关，在APP/PS1小鼠中，Aβ也与星形胶质细胞的过度活跃有关。因此，研究人员对分化5周的3D-AD培养模型中细胞自发活性进行检测，他们利用钙成像技术分析了捕获的视频中所有活跃细胞（>0个瞬时变化次数，每50帧/4.5分钟）中钙离子浓度，并将每50帧/4.5分钟瞬变次数大于6次（高于活跃细胞的平均频率）的细胞定义为超活跃细胞（图 1F）。研究人员观察到，在3D-AD培养模型中，Irisin略微降低了过度活跃细胞的百分比（图 1G）。与ReN-GA培养模型相比，在培养5周的ReN-mGAP模型中，在所有绿色荧光蛋白（GFP）细胞中，过度活跃细胞的比例明显更高（图1H）。重要的是，研究人员发现在ReN-mGAP模型中，Irisin显著降低了GFP细胞总数中过度活跃细胞的比例，但对活跃细胞的平均频率没有影响；而在ReN-GA模型中，Irisin处理没有观察到任何变化（图 1H）。这些结果表明，Irisin降低了Aβ和Aβ相关的萎缩性神经突以及3D-AD培养模型中细胞的过度兴奋性。

3 Irisin提高分泌型NEP水平

接下来，研究人员探究了Irisin是否通过增强酶降解或吞噬Aβ来减少Aβ。脑啡肽酶（NEP）、胰岛素降解酶（IDE）以及它们的分泌形式——分泌型脑啡肽酶（secNEP）和分泌型胰岛素降解酶（secIDE），都是星形胶质细胞产生的蛋白酶，已被证明能降解Aβ。研究人员首先检测了经Irisin处理的3D-AD培养模型条件培养基中secNEP和secIDE的活性，发现Irisin能显著提高secNEP的活性，但不能提高secIDE的活性（图2A和S2D）。为了检测secNEP活性的增加是secNEP表达增加的结果还是酶活性增强的结果，研究人员检测了经Irisin处理的3D-AD模型条件培养基中secNEP的水平。根据糖基化的不同，NEP的分子量在80-110 kDa之间。在野生型小鼠脑裂解物中，检测到的NEP分子量略低于98 kDa；而在小鼠血浆样本中NEP条带略高于98 kDa，这可能是糖基化的secNEP形式（图S2E）。在3D-AD模型的条件培养基中，研究人员检测到的secNEP大于98 kDa，与小鼠血浆中检测到的NEP一致（图2B和S2E）。重要的是，Irisin显著增加了培养5周后的ReN-GA和ReN-mGAP模型条件培养基中的secNEP蛋白水平，而没有改变secIDE蛋白水平（图2B）。5ng/mL的Irisin不会增加ReN-mGAP培养基中的secNEP水平和活性（图2A和2B）。这些数据表明，Irisin诱导的secNEP活性增加是Irisin上调secNEP蛋白水平的结果。在AD-3D培养模型的基质胶中检测到的NEP小于98 kDa（图S2F），与小鼠脑裂解物中检测到的NEP相似（图S2E）。此外，在培养5周后的 ReN-GA 细胞中，Irisin对于 NEP 的蛋白质和mRNA水平都没有影响（图2C和S2F）。NEP/secNEP抑制剂沙库巴曲缬沙坦（Sacubitril）完全阻断了3D-AD模型条件培养基中secNEP的活性（图S2G）。与只用Irisin处理的组相比，Sacubitril和Irisin同时处理可显著提高3D-AD模型中Aβ42的水平（图2D），这表明secNEP的活性对于Irisin降低ReN-GA和ReN-mGAP模型中Aβ42的水平是必需的。与空白处理组相比，同时使用sacubitril和Irisin处理仍可减少ReN-GA 模型中的Aβ42，这表明Irisin减少ReN-GA模型中Aβ42的机制可能还包括其他机制。虽然sacubitril单独处理会显著降低3D-AD模型中secNEP的活性（图S2G），但并不影响Aβ的水平（图2D）。3D-AD模型中的内源性secNEP水平较低，可能不会受sacubitril处理的影响而改变Aβ的水平。

本文中的3D-AD模型由神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞组成。为了检测星形胶质细胞是否是Irisin诱导的secNEP 增加的来源，研究人员将人源多能干细胞衍生的星形胶质细胞（hiPSC-Astro）进行3D-AD培养，并用Irisin处理。结果表明Irisin处理增加了hiPSC-Astro条件培养基中secNEP的活性（图2E），这与上文两种3D-AD模型中观察到的结果相似。这些结果表明，Irisin通过增加星形胶质细胞中secNEP的释放，缓解了Aβ在3D-AD模型中的病理变化。

图 2| Irisin能增加星形胶质细胞中的secNEP水平

图 S2| 3D-AD培养中APP加工、Aβ聚集、NEP蛋白表达和secNEP/secIDE活性

4 星形胶质细胞中的整合素αV/β5受体是Irisin诱导Aβ水平降低的必要条件

研究人员之前在骨细胞和脂肪组织中发现整合素复合物αV/β5是一种Irisin受体。在中枢神经系统（CNS）中，整合素β5（ITGB5）亚基在星形胶质细胞中高度表达，可作为星形胶质细胞特异性基因，适用于分离星形胶质细胞。整合素αV亚基是ITGB5的专属伴侣。研究人员通过质谱法（MS）检测了培养5周的ReN-mGAP模型中整合素αV和β5亚基的表达，并通过Western印迹检测了ReN-GA模型中整合素αV和β5亚基的蛋白表达水平（图3A）。在培养5周的ReN-mGAP模型中，研究人员用星形胶质细胞选择性毒素L-α-氨基己二酸盐（L-AAA）清除星形胶质细胞后发现， ITGB5和S100β（星形胶质细胞标记物）的蛋白水平显著降低（图 3B），表明ITGB5主要在3D-AD模型中的星形胶质细胞中表达。

配体结合后，异二聚体整合素受体通过磷酸化黏着斑激酶（p-FAK）和环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）触发典型信号传导。在ReN-mGAP和 hiPSC-Astro 模型中，Irisin处理增加了p-FAK和CREB磷酸化（p-CREB）水平，表明Irisin诱导了整合素受体的快速活化（图3C和3D），说明在3D-AD和hiPSC-Astro模型中存在整合素信号并被Irisin激活。

为了确定整合素αV/β5受体是否是Irisin降低Aβ水平的必要条件，研究人员在ReN-mGAP模型中通过药物抑制ITGB5活性，在ReN-GA模型中抑制ITGB5基因表达（小编注：文中并没有提到为什么对这两种细胞进行不同处理，我们猜测一方面可能是因为本身就具有两种AD模型细胞，为了减少工作量，所以使用了不同的策略在两种模型中均证明了irisin是通过是其受体αV/β5来降低Aβ含量。另一方面可能是他们在两种模型都做了药物和基因操纵，但在文中展示了不同的数据）。为了从药理学角度抑制整合素αV/β5的活性，他们用拮抗整合素αV/β5抗体或整合素αV/β5抑制剂（SB273005）处理培养3.5周的ReN-mGAP模型1.5周。结果表明，培养5周ReN-mGAP细胞中，整合素αV/β5抗体或SB273005的处理完全消除了Irisin降低Aβ42水平的作用（图 3E）。SB273005处理也消除了Irisin增加ReN-mGAP培养基中secNEP活性的能力（图 3F）。为了从基因上阻断ITGB5 的活性，研究人员通过过表达诱导性慢病毒ITGB5短发夹RNA（shRNA）生成了 ITGB5敲减（KD）-ReN-GA株系，其表达受多西环素（Dox）控制（图 3G）。他们发现，在培养5周的ReN-GA模型中敲减ITGB5后，Irisin失去了ReN-GA模型中降低Aβ40和Aβ42水平的能力（图 3H）。此外，Dox不会影响Aβ 水平（图 S3A）。这些结果表明，整合素αV/β5在星形胶质细胞中作为Irisin的受体，并介导Irisin降低3D-AD模型中Aβ水平的能力。此外，研究人员还观察到，在没有Irisin处理的情况下，单独对整合素αV/β5进行药物抑制会降低3D-AD模型中Aβ40和Aβ42水平（图S3B和S3C）。

图 3| 星形胶质细胞中的整合素αV/β5受体介导Irisin降低Aβ的作用

图 S3| 整合素αV/β5抑制或多西环素治疗后3D-AD培养物中的Aβ水平和用Irisin治疗的hiPSC-Astro培养物中的STAT3信号传导

5 Irisin通过整合素αV/β5抑制 STAT3 信号传导

有研究表明，在APP/PS1小鼠的星形胶质细胞中特异性敲除STAT3可减少 Aβ负荷，同时增加NEP蛋白水平，尽管NEP的细胞来源尚未明确。研究人员评估了用Irisin处理培养5周的ReN-GA模型中Stat3基因表达水平以及部分反应性星形胶质细胞标记物，包括Gfap、Cp、Cd44、C3、Serping1、Amigo2和Emp152（图 4A）。结果表明，当用单因素方差分析时，500 ng/mL剂量的Irisin处理ReN-GA模型后，C3（p = 0.086）和 Stat3（p = 0.094）基因表达呈下降趋势（图 4A）。然而，当用t检验进行分析时，这两种基因表达减少具有统计学差异（图 S3D）。Irisin处理培养5周ReN-GA细胞后，C3和C3aR以及它们上游的核因子κB（NF-κB）p65蛋白和STAT3水平下降（图4B）。同时使用整合素αV/β5抗体处理会削弱Irisin减少STAT3、C3aR和NF-κB p65的能力，而不添加Irisin，仅使用αV/β5抗体处理不会改变它们的水平（图 4B、S3E 和 S3F），这表明Irisin诱导的这些蛋白的减少是由星形胶质细胞通过整合素αV/β5受体介导的。在hiPSC-Astro模型中，Irisin能降低NF-κB p65、C3、C3aR和STAT3 的蛋白水平，进一步证实了这些发现（图 S3G）。接下来，MS和Western印迹分析表明，在培养5周的ReN-mGAP和ReN-GA以及hiPSC-Astro模型中，Irisin降低了脂蛋白E (APOE) 的水平，APOE是STAT3在星形胶质细胞中的下游，只在胶质细胞中表达，这进一步证明了Irisin降低STAT3的作用（图4C、S3H和S3I）。用整合素αV/β5抗体或拮抗剂SB273005联合处理ReN-mGAP模型后，Irisin诱导的APOE水平降低再次消失（图4C和S3F）。

STAT3已被证明可调节星形胶质细胞的反应性。为了检验Irisin介导的 STAT3减少是否会改变星形胶质细胞的反应性，研究人员在用Irisin处理培养2周和 5周ReN-mGAP模型中检测了反应性星形胶质细胞标记物神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100β的蛋白水平。Western印迹分析表明，Irisin处理可显著降低5周ReN-mGAP模型细胞中的GFAP和S100β蛋白水平（图4D和S3J）。即使在5ng/mL的Irisin浓度下也能观察到这一现象，而在培养2周的ReN-mGAP 模型中，Irisin不能减少Aβ的病理变化（图S1B和S3K）。这些数据表明，Irisin引起的GFAP减少并不是由于Irisin诱导的NEP分泌增加导致Aβ减少的继发效应。

图 4| Irisin通过整合素αV/β5抑制STAT3信号转导，并减弱反应性星形胶质细胞基因和蛋白质的表达

6 Irisin能抑制反应性星形胶质细胞基因和蛋白质的表达

为了描述Irisin处理诱导的细胞类型特异性转录组变化，研究人员在Irisin和抗整合素αV/β5抗体联合处理后，对培养5周的3D-AD模型进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。在ReN-GA模型中，他们根据标记物的表达（星形胶质细胞：Gfap、Aqp4和Id4；神经元：Wsb1、Kcnq1ot1、Syt1和Kcnj6）从完整数据集中提取了2671个星形胶质细胞和1207个神经元（图S4A 和S4B）。Irisin处理使神经元和星形胶质细胞的基因表达发生了显著变化（图 S4C）。在星形胶质细胞中，基因本体分析显示Irisin上调了参与基因表达、RNA核输出、细胞质翻译、RNA代谢过程、蛋白质靶向ER和白介素-1产生的调控基因（[FDR] < 0.1）（图S4D）。在神经元中，Irisin下调了参与应激诱导早衰、淀粉样纤维形成、ERK1和ERK2级联正向调控、细胞蛋白代谢过程负向调控和Aβ形成调控的基因，而上调了参与细胞蛋白代谢过程、端粒延长对端粒维持的正向调控、神经元生成、RNA代谢过程和神经元发育的基因（FDR < 0.1）（图 S4E），说明Irisin可以延缓衰老，抑制淀粉样纤维形成，以及Aβ形成。其中，抑制ERK信号通路，促进神经元发育与生成，说明Irisin可以减轻Aβ病理变化。

与ReN-GA模型相比，ReN-mGAP模型的神经元损害更为严重，研究人员在其中提取了1821个星形胶质细胞和695个神经元（图4E和4F）。Irisin处理可显著改变神经元的基因表达，尤其是星形胶质细胞的基因表达（图 4G）。在星形胶质细胞中，基因本体分析表明，Irisin下调了参与细胞过程负调控、细胞凋亡过程调控、细胞金属离子平衡、向细胞内导入和细胞代谢过程负调控的基因（FDR < 0.1）（图4H）。在神经元中，Irisin下调了参与侵袭吞噬、p53类介质信号转导正调控、泛素蛋白连接酶活性负调控、翻译和信号识别颗粒（SRP）依赖的共翻译蛋白靶向膜的基因（FDR < 0.05）（图4I）。

重要的是，Irisin能明显降低星形胶质细胞反应性标记物，如波形蛋白（Vimentin，Vim）、S100b、Hspb1、Camk2d、Gpx1、Lgals1、Lgals3、Flna、Vcan 和Nes的基因表达水平，而抑制整合素αV/β5后这一现象就消失了（图4J和S4F）。此外，在星形胶质细胞中，Irisin减少了表皮生长因子受体（Egfr）基因及其下游效应基因（包括白细胞介素（IL）-6 通路（Mapk1/Erk，Il6st））和Apoe基因的表达，这些基因在反应性星形胶质细胞中通过整合素αV/β5受体上调（图 4K）。

质谱MS结果进一步证明，在培养5周的ReN-mGAP模型中，Irisin抑制了EGFR和其下游通路的蛋白水平，其对星形胶质细胞反应至关重要（图 S4G）。Irisin改变了培养5周ReN-mGAP 模型中反应性星形胶质细胞基因的蛋白水平（图S4H）。研究人员观察到CAMK2D 和GPX1蛋白表达呈下降趋势（与scRNA-seq分析一致）（图 S4H）。尽管没有观察到"A1"和"A2"活化状态之间的明显转变，但Irisin处理后"pan"-星形胶质细胞标志基因（小编注：星形胶质细胞“泛”标志物，标记由炎症和缺血诱导的反应性星形胶质细胞的类型）有下调的趋势（图S4H）。根据基因本体对反应性星形胶质细胞相关基因进行分类，他们发现在ReN-mGAP模型中，与细胞外基质（ECM）重塑（CD44）、IL-6信号转导（RRAS2）和 GAP43（神经调节蛋白）相关的基因的蛋白表达在Irisin的作用下显著下降（图S4H）。

图 S4| 用Irisin处理的3D-AD培养物的转录组学和质谱分析

7 阻断STAT3信号传递可提高secNEP水平

接下来，研究人员探究了Irisin是否通过下调STAT3来增加secNEP水平。因此，研究人员构建了携带可由Dox调节的shRNA转基因的ReN-GA细胞，该转基因可沉默STAT3基因的表达（图5A）。STAT3 KD能显著提高培养5周的STAT3 KD-ReN-GA模型条件培养基中secNEP的水平及其活性，而降低secIDE 的水平（图5B和5C）。在没有用Irisin处理时，STAT3 KD降低了培养5周ReN-GA模型条件培养基和细胞中的Aβ40和Aβ42水平（图5D），而仅用Dox处理不会降低Aβ水平（图S3A）。由于在3D-AD模型中STAT3的缺失并非星形胶质细胞特异性的，因此需要进一步证实星形胶质细胞特异性STAT3缺失的效果。总之，这些结果表明，降低星形胶质细胞中STAT3的表达是Irisin诱导NEP释放增加从而减少3D-AD模型中Aβ水平的分子机制中的一个关键事件。

图 5| 阻断STAT3信号传递可提高secNEP水平

8 Irisin通过抑制IL-6/ERK信号转导来降低STAT3水平，从而增加secNEP的释放量

有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）/ERK信号通路在人类反应性星形胶质细胞和AD大脑中长期激活，而IL-6是ERK和STAT3信号通路的上游激活剂。FNDC5/Irisin可调节MAPK/ERK信号通路。之前的scRNA-seq和MS结果表明Irisin抑制了IL-6/MEK-ERK/STAT3 通路（图4K、S4E和S4G）并减弱了星形胶质细胞的反应性（图4和S4），因此研究人员检测了Irisin是否改变了培养5周3D-AD模型中促炎细胞因子包括IL-6、磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204处磷酸化）和总ERK的水平。

研究人员测量了培养5周的3D-AD模型条件培养基中的干扰素-γ (IFN-γ)、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，发现5ng/mL和500 ng/mL的Irisin能显著降低IL-6水平（图6A）。此外，500 ng/mL的Irisin还能提高IL-2的水平（图S5A）。Western 印迹分析表明，Irisin处理24小时后，ReN-GA和ReN-mGAP模型中p-ERK的水平明显降低（图6B和S5B）。

接下来，研究人员想知道Irisin对ERK的抑制是否会降低STAT3的水平，从而促进NEP活性/水平的提高。因此，研究人员用U0126（一种高选择性的丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）1/2（MAPK/ERK 激酶的一种）抑制剂）处理了培养3.5周的ReN-GA模型1.5周。在培养5周的ReN-GA模型中，U0126（25 μM）显著降低了总STAT3及其磷酸化形式（Tyr705处的磷酸化）的蛋白表达水平（图 6C），证明ERK活性调控STAT3蛋白表达。重要的是，U0126处理显著提高了 ReN-GA模型条件培养基中的secNEP活性和secNEP 蛋白水平，导致其培养基和细胞中的Aβ40和Aβ42水平降低（图6D、6E和S5C）。当同时用sacubitril处理来阻断NEP活性时，U0126降低条件培养基和细胞中Aβ42水平的作用就消失了（图6E）。这些发现表明，U0126降低Aβ水平需要增加secNEP活性。与Irisin相似，U0126处理并没有改变ReN-GA模型细胞中Nep的mRNA水平（图S5D）。研究人员进一步发现，U0126处理会增加hiPSC-Astro模型条件培养基中secNEP蛋白的水平，而会降低其胞裂解物中NEP的水平，这表明ERK抑制可能会促进星形胶质细胞分泌NEP（图S5E和S5F）。

值得注意的是，IL-6是NF-κB依赖性最强的细胞因子之一。研究人员发现在培养5周的3D-AD模型中抑制ERK导致其细胞中NF-κB p65蛋白表达减少和条件培养基中IL-6水平下调（图S5G和S5H）。这些结果表明，Irisin抑制了ERK-STAT3/NF-κB通路，提高了NEP的活性/水平，从而缓解3D-AD模型中Aβ病理变化（图7）。

图 6 | Irisin抑制IL-6/ERK信号传导，减少STAT3信号传导，从而提高secNEP水平

图 S5| Irisin诱导的促炎细胞因子变化和ERK活化减少，以及U0126通过促进星形胶质细胞NEP诱导的Ab减少分泌

图 7| Irisin作用机制示意图

9 A1诱导剂可降低hiPSC-Astro模型细胞裂解物中的NEP水平

此前已有研究表明，NEP在斑块周围的GFAP+反应性星形胶质细胞中强表达。然而，本篇研究结果表明，Irisin处理后，星形胶质细胞的GFAP表达减少，NEP分泌增强（图4、图5、图6和图7）。还应注意的是，运动会增加NEP的活性，从而减弱星形胶质细胞的反应性。为进一步了解星形胶质细胞NEP 分泌与星形胶质细胞反应性之间的关系，研究人员用A1诱导剂处理hiPSC-Astro模型，这些诱导剂包括IL-1α (3ng/mL)、TNF-α (30ng/mL) 和C1q (400ng/mL) 重组蛋白。IL-1α、TNF-α和C1q能显著提高促炎细胞因子的水平，但C3的水平却没有提高，这一现象导致条件培养基和细胞裂解物中NEP和IDE蛋白表达水平没有变化（图 S6A-S6D）（小编注：早期反应性星形胶质细胞可分为A1型毒性星形胶质细胞（表达补体C3）和A2型保护性星形胶质细胞（不表达补体C3）。这里作者使用A1诱导剂处理hiPSC-Astro模型诱导细胞，尽管提高了促炎因子的表达，但C3水平没有提高，提示星形胶质细胞的反应性没有变化。因为NEP在反应性星形胶质细胞中强表达，所以NEP表达水平没有变化，下面的结果中作者使用了另一中A1诱导剂，显著提高了C3的表达，说明星形胶质细胞的反应性发生变化，进而NEP蛋白表达减少，说明星形胶质细胞NEP 分泌与星形胶质细胞反应性之间存在关系）。

有趣的是，当研究人员用IL-1β（10 ng/mL）和IFN-γ（10 ng/mL）联合IL-1α、TNF-α和C1q共同处理以诱导 C3+ A1 星形胶质细胞时（图S6E），他们观察到细胞裂解物中NEP蛋白表达减少，但在hiPSC-Astro条件培养基中没有减少（图S6E-S6G）。这些发现表明，尽管神经毒性A1星形胶质细胞中的胞内NEP已耗竭，但NEP 的分泌并未受到影响。

图 S6| 用A1星形胶质细胞诱导剂处理的hiPSC-Astro培养物中细胞因子、C3和secNEP/NEP的水平

10 Irisin能降低磷酸化tau水平

为了研究Irisin对tau磷酸化的影响，研究人员用Irisin处理培养3.5周的ReN-mGAP模型1.5周。Irisin（500 ng/mL）显著降低了培养5周ReN-mGAP模型中可溶于/不可溶于十二烷基肌氨酸钠（sarkosyl）配对螺旋样纤维（PHF）-1⁺磷酸化Tau（pTau）（Ser396/Ser404）的水平（图S7A和S7B），而pTau/总tau比值没有变化，这是因为Irisin处理有降低总tau水平的趋势（图S7C和S7D）。Irisin能显著降低PHF-1⁺ pTau水平（图S7E）。这些结果表明，Irisin具有缓解tau病变的潜力。

图 S7| Irisin降低5周分化的ReN-mGAP培养物的3D凝胶中可溶性和不溶性PHF-1⁺ p-tau水平

总结 

阿尔茨海默病（AD）的病理标志是淀粉样蛋白-β（Aβ）在大脑中的沉积。研究表明，体育锻炼可减少各种阿尔茨海默病小鼠模型中的Aβ积累，但其潜在机制尚未阐明。Irisin是一种运动诱导激素，是Ⅲ型纤连蛋白域蛋白（FNDC5）的分泌形式。在这里，研究人员利用三维（3D）细胞培养模型研究发现，Irisin能增加星形胶质细胞释放Aβ降解酶NEP（neprilysin），从而显著减轻Aβ病理变化。在机制上，Irisin下调了ERK-STAT3信号传导。最后，他们发现整合素αV/β5是星形胶质细胞上的Irisin受体，Irisin诱导星形胶质细胞释放NEP，从而清除Aβ。作者的研究结果首次揭示了运动诱导的Irisin减轻Aβ病理变化的细胞和分子机制，为预防和治疗AD的疗法提出了一个新的靶点途径。

原文链接：https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(23)00623-2