背景介绍

棕色脂肪细胞线粒体中富含UCP1蛋白，UCP1通过将氧化磷酸化与ATP合成解偶联，把底物氧化产生的能量转化为热能，以此促进棕色脂肪产热，帮助机体抵御寒冷，并改善肥胖以及相关代谢紊乱，是治疗肥胖及代谢疾病的重要靶标。近年来，研究人员发现棕色脂肪中还存在不依赖于UCP1的产热途径，例如，产热脂肪内质网中存在SERCA-兰尼碱受体的无效循环产热机制，通过Ca2+进出内质网的无效循环过程来促进产热，即SERCA2B摄取Ca²⁺进入内质网，RYR2和IP3R释放Ca²⁺的过程，这一过程与SERCA2B水解ATP相偶联，从而介导产热作用。另外，有研究发现肾上腺素刺激会促进BAT细胞Ca²⁺以SOCE（Store-operated Ca²⁺ entry）途径内流，通过促进脂肪酶HSL和ATGL的表达，以及激活cAMP依赖的HSL活性，促进脂肪分解，从而促进产热。而细胞膜上KCNK3蛋白作为负反馈调节因子介导细胞内K⁺外排，抑制由肾上腺素诱导的Ca²⁺内流及其介导的产热作用，这表明BAT细胞内Ca²⁺在产热作用中发挥着重要作用。而线粒体作为细胞内Ca²⁺储存的另一个重要场所，Ca²⁺是否参与调控UCP1依赖的产热作用，目前尚不清楚。MCU复合物（线粒体Ca2+单向转运体）是负责线粒体Ca²⁺摄取的主要通道，位于线粒体内膜，由1个孔道形成亚基（MCU）和几个调节亚基组成，调节亚基包括EMRE（MCU调节因子）、MICU1/2（线粒体钙摄取蛋白1/2）等。有研究发现MCU复合物介导Ca²⁺摄入，激活Ca²⁺敏感的TCA循环相关酶（如丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶），促进TCA循环，为氧化磷酸化提供底物，从而促进ATP的合成。不同的组织中MCU复合物的活性差异较大，通过对线粒体内膜进行膜片钳记录分析来比较各组织中MCU复合物的活性，发现BAT和骨骼肌中MCU活性显著高于心脏、肝脏、肾脏等其他代谢组织，表明MCU复合物在BAT组织中可能发挥着重要的生理功能，然而，MCU复合物介导线粒体Ca²⁺摄入是否参与调节BAT产热作用，目前还不清楚。在本篇文章中，研究人员发现在肾上腺素刺激下，BAT细胞中MCU通过EMRE与UCP1相互作用，形成MCU-EMRE-UCP1复合物（即产热通道）来促进UCP1介导的产热作用。而BAT特异性敲除Mcu或Emre的小鼠表现出冷不耐受，以及UCP1介导的产热受损现象。该研究结果为肥胖及其相关代谢疾病的预防和治疗提供了新靶标。

敲黑板啦！

 研究结果

为了探究MCU在线粒体解偶联呼吸调控中的作用，研究人员首先检测了BAT线粒体中MCU复合物中3个主要亚基（EMRE，MCU，MICU1）的表达水平，发现与热中性条件相比，冷刺激条件下EMRE的基因表达和蛋白表达水平均显著上调，且与UCP1和PGC1α表达水平呈正相关(Figures 1A and 1B)。为了确定MCU在BAT产热中的功能，研究人员将Mcu^f/f小鼠与Ucp1^Cre小鼠进行杂交，构建棕色脂肪特异性敲除Mcu小鼠（即Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠）(Figure S1A)。由于EMRE是哺乳动物MCU复合物活性所必需的，介导MCU亚基和MICU1亚基相互作用，因此研究人员在Rosa26-LSL-Cas9;Adipoq^Cre小鼠BAT中注射靶向Emre的AAV-gRNA，利用CRISPR-Cas9手段构建了BAT特异性敲除Emre小鼠（Emre-BKO小鼠）(Figure S1B)，发现棕色脂肪中MCU的缺失并不影响UCP1表达水平和BAT组织重量，表明MCU不调控BAT的发育 (Figures S1C and S1D)。接下来，研究人员通过监测Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠在空腹-寒冷条件下的核心体温，发现Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠均表现出冷不耐受现象 (Figures 1C-1D and S1E–S1J)。将Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠在热中性（30℃）环境中饲养3周后再进行短期冷刺激，发现Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠核心体温显著低于WT小鼠(Figure S1K)，红外热成像分析结果显示在禁食-冷刺激期间Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠肩胛骨BAT区域的表面温度明显低于WT小鼠(Figures 1F and 1G)，同样在Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠BAT中植入温度探针，结果也显示Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠BAT温度明显低于WT小鼠(Figure 1E)。

为了探究Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠的冷不耐受现象是否是由于BAT非震颤性产热能力受损而非骨骼肌震颤性产热受损，研究人员对麻醉小鼠BAT局部注射NE（去甲肾上腺素），通过检测Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠VO2水平（耗氧量）来确定小鼠BAT的产热能力，发现Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠的耗氧量显著低于WT小鼠(Figures 1H and 1J)。由于在麻醉状态下，NE诱导的产热主要由BAT线粒体脂肪酸氧化所驱动（小编注：在麻醉状态下骨骼肌松弛，不会发生震颤性产热。参考文献：Naoya Kataoka, et al. Cell Metab. 2014 Aug 5;20(2):346-58.；Christian T McHugh, et al. EJNMMI Res. 2020 Nov 7;10(1):136. ），因此研究人员进一步检测了BAT脂肪氧化率，发现Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠脂肪氧化率也明显减弱(Figures 1I and 1K)。此外，Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠BAT局部注射CL-316,243（β3肾上腺素受体特异性激动剂）也表现出与NE刺激时类似的BAT产热受损现象(Figures S1L and S1M)。总之，这些结果表明棕色脂肪MCU或EMRE的缺失损害了小鼠的非震颤性产热。

此外，HE染色结果也显示在禁食-冷刺激条件下，与WT小鼠相比，Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠BAT组织的棕色化现象明显减弱(Figure S1N)。为了进一步探究棕色脂肪MCU的缺失如何影响BAT的产热功能，研究人员通过利用GDP（鸟苷二磷酸）处理抑制UCP1（小编注：嘌呤核苷酸（ATP、ADP、GTP、GDP）可通过直接与UCP1结合而有效抑制UCP1解偶联活性。参考文献：Paul Cohen, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Jun;22(6):393-409.）来检测BAT线粒体的解偶联呼吸水平，发现Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠和Emre-BKO小鼠BAT中UCP1依赖的呼吸作用显著降低，而Emre-BKO小鼠BAT中回补EMRE可恢复UCP1依赖的呼吸作用(Figures 1L, 1M, and S1O)。这些结果表明MCU对UCP1依赖的BAT产热是必需的。

Figure 1. BAT产热需要MCU

Figure S1. 线粒体Ca²⁺单转运体对BAT产热至关重要

为了探究MCU如何调控UCP1介导的BAT产热作用，研究人员在WT小鼠BAT中过表达带Strep标记的MCU，随后纯化MCU复合物进行质谱分析，发现MCU复合物可能与UCP1存在相互作用关系(Figure 2A)。经coIP实验验证确定MCU与UCP1而不是ANT1（UCP1所属的SLC25a家族的另一个成员）相互作用(Figure 2B)。此外，将纯化的MCU复合物进行BN-PAGE（蓝绿温和胶电泳）分析，结果显示MCU-EMRE复合物在480-650kDa位置迁移，而UCP1与MCU复合物在550-650kDa处共迁移，敲除UCP1后，MCU复合物在BN-PAGE中的迁移速度更快，处于480-550kDa位置(Figure 2C)，这表明UCP1与MCU复合物相互作用。免疫金标记显示MCU复合物与UCP1均定位于BAT线粒体嵴上(Figures S2A and S2B)。并且，敲除Emre后可抑制MCU与UCP1的相互作用，而敲除Micu1并没有这一现象，表明UCP1以EMRE依赖的方式与MCU结合(Figures 2D and 2E)。为了探究UCP1是否与EMRE直接结合，研究人员在HEK 293T细胞中双敲除Mcu和Emre，随后回补Mcu或者Emre，以检测Mcu或Emre与UCP1的相互作用，发现在缺失Emre时，UCP1与MCU并不结合，而缺失MCU时，UCP1可以与EMRE相互作用，且只有WT EMRE存在时UCP1可与MCU相互作用，EMRE突变体（S85W）并不能使UCP1与MCU结合，这进一步表明Emre介导了UCP1与MCU的相互作用(Figure 2F)。接下来，研究人员想要进一步鉴定EMRE与UCP1相互作用的特定位点。有研究表明EMRE的TMH（跨膜螺旋）结构域是EMRE-MCU相互作用所必需的，因此研究人员利用人工跨膜WALP螺旋（GWWLALALALALALALWWA）取代EMRE的TMH结构域（并不会改变EMRE的线粒体定位）（小编注：TMH结构域中含有GXXX（G/A/S）基序，而WALP螺旋没有这一结构，因此WALP螺旋不具有单向转运体活性），来检测TMH结构在EMRE-UCP1结合中的作用，发现TMH结构域同样也是EMRE-UCP1结合所必需的(Figure 2G)。据报道，EMRE的G81和S85位点对EMRE-MCU复合物的形成至关重要，因此研究人员进一步探究了它们的相对位点I75和L83（小编注：相对位点是指螺旋结构上G81和S85对面的氨基酸）是否与EMRE-UCP1的结合有关。研究人员将这两个位点突变为色氨酸（I75W，L83W）并检测EMRE突变体与UCP1的结合能力，推测该突变可能会破坏EMRE的螺旋结构从而影响EMRE与UCP1的相互作用，然而结果显示EMRE-WT、I75W和L83W与UCP1的结合能力并没有差异(Figure S2D)。接下来，研究人员对I75-A90这一段侧链进行色氨酸扫描突变，并没有识别出可以破坏EMRE-UCP1结合作用的突变位点(Figure S2E)。研究人员推测可能需要同时突变多个氨基酸位点才能破坏EMRE-UCP1的结合作用。此外，以往研究利用计算机模拟和蛋白结构分析发现EMRE和UCP1均与心磷脂相互结合，因此另一种推测可能是线粒体内膜上的心磷脂参与了EMRE-UCP1的相互作用（小编注：心磷脂是存在于线粒体内膜上的一种脂质，在HEK293T细胞中也有）。

Figure 2.棕色脂肪细胞中MCU-EMRE和UCP1相互作用形成复合物

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 6.产热通道的形成可治疗肥胖

由于肾上腺素诱导产热通道的形成可促进BAT产热，因此研究人员想要进一步探究靶向促进产热通道的形成是否可以改善肥胖及其相关代谢疾病。ob/ob小鼠由于BAT和scWAT（皮下脂肪组织）交感神经减少而导致产热能力受损，于是研究人员将ob/ob小鼠BAT中过表达AAV-EMRE-UCP1，以促进产热通道的形成，发现在寒冷刺激下小鼠的核心体温显著升高，小鼠的产热能力也显著增强(Figures 6A, 6B, and S7A)。随后，研究人员对WT小鼠BAT过表达AAV-EMRE-UCP1，并饲喂高脂饮食（HFD），发现与对照小鼠相比，过表达AAV-EMRE-UCP1的小鼠体重体脂显著降低，能量消耗显著增加，糖稳态明显改善，且脂肪、肝脏和肌肉组织对胰岛素刺激更加敏感(Figures 6C-6J and S7B-S7D)。接下来，研究人员对Micu1-BKO小鼠饲喂HFD饮食，发现Micu1-BKO小鼠表型与BAT过表达AAV-EMRE-UCP1小鼠相似，即与WT小鼠相比，Micu-BKO小鼠体重体脂显著降低，能量消耗增加，糖稳态改善以及全身胰岛素敏感性增加(Figures 7A-7F and S7E-S7J)。最后研究人员对Mcu^f/fUcp1^Cre小鼠饲喂HFD饮食，发现与WT小鼠相比，BAT组织敲除Mcu后小鼠体重体脂显著增加，能量消耗降低，糖稳态以及全身胰岛素敏感性进一步受损(Figures 7G-7L and S7K-S7N)。总之，这些结果表明靶向促进产热通道的形成是治疗肥胖及其相关代谢性疾病的一种有效策略。

Figure 6. 促进产热通道的形成可促进ob/ob小鼠的BAT产热作用，并防止HFD诱导的肥胖和代谢紊乱

Figure 7. BAT中缺失Micu1或Mcu可调控HFD诱导的肥胖和代谢功能障碍

Figure S7. 促进产热通道的形成可治疗肥胖

总结 

总之，本研究发现在肾上腺素刺激下（如冷刺激，NE/CL-316,243刺激），BAT细胞中MCU通过EMRE与UCP1相互作用，形成MCU-EMRE-UCP1复合物（即产热通道），促进BAT线粒体钙摄取以及UCP1依赖的产热作用。MICU1通过与MCU-EMRE相互作用，抑制产热通道的形成，从而负调控BAT产热功能。因此，BAT组织缺失MCU或EMRE会损害BAT产热功能，加剧肥胖和代谢功能障碍，而敲除BAT组织MICU1或者在BAT组织中过表达AAV-EMRE-UCP1，可通过促进BAT线粒体中产热通道的形成，改善肥胖及其相关代谢性疾病。总而言之，这些结果表明靶向促进BAT中产热通道的形成可能是治疗肥胖及其相关代谢性疾病的一项有效治疗手段。

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